2005年, 第35卷, 第2期　刊出日期：2005-04-10

  

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病原学
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  嵌套引物P1/P7-U3/U5检测葡萄黄化(stolbur)植原体时扩增出的额外片段分析

  葛泉卿, M. MAIXNER, 温孚江

  植物病理学报. 2005, 35(2): 97-103.

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  当采用嵌套引物P1/P7(U5/P7) U3/U5的巢式PCR检测植原体时,伴随着正常的0.85kb片段还经常扩增出一条额外片段。与其它常见的非特异性片段不同,该额外片段十分稳定,与正常片段总是同步出现,二者的强度呈正比。经测定,额外片段的大小为0.36kb。迄今,这一现象仅在采用P1/P7(U5/P7)-U3/U5引物的巢式PCR中出现。在采用P1/P7、U5/P7或-U3/U5引物的常规PCR中从未出现过。另外,已知这一现象至少在葡萄黄化stolbur和榆黄化植原体的检测过程中出现。对该现象产生的原因进行了深入研究,方法是将额外片段从凝胶中分离出来,用不同的引物在不同的条件下进行重新扩增,同时结合已知的植原体16SrRNA基因序列进行综合分析判断。结果表明,该额外片段源于植原体16SrRNA基因上存在的一个与U5引物部分互补的位点。对额外片段的测序结果进一步证实了分析的正确性。据此,指出了该额外片段在植原体检测中的可能用途。
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  马铃薯类病毒(PSTVd)非放射性标记cDNA探针制备及其在检测上的应用

  吕典秋, 李学湛, 于德才, 胡林双, 杨希才

  植物病理学报. 2005, 35(2): 104-108.

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  利用含PSTVd单体克隆的重组质粒pGEM PSTVd,通过PCR扩增技术,用生物素标记制备cDNA探针,进行杂交反应检测PSTVd,其中通过化学颜色反应进行判读灵敏度可达50pg,而用化学发光反应进行判读灵敏度可达5pg,分别是R-PAGE检测灵敏度的26倍和260倍,且2种反应特异性和专化性较强。cDNA核酸斑点杂交反应(NASH)检测PSTVd方法准确、灵敏度高,一次检测样品数量多,且对异地样品检测非常方便,是以往其它检测方法的有效补充。
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  马铃薯种苗复合感染病毒多重RT-PCR同步快速检测

  王中康, 夏玉先, 袁青, 谭万忠, 殷幼平

  植物病理学报. 2005, 35(2): 109-115.

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  基于马铃薯病毒ssRNA的快速制备方法,根据马铃薯病毒CP基因序列设计PVX、PVS、PVY和PLRV特异性引物对、P1基因序列设计PVA特异性引物对,建立了多重RT PCR快速检测体系,可以同步检出复合侵染马铃薯种苗主要病毒,灵敏度比传统的ELISA至少高100倍。结合生物活性稳定剂研制的固相化检测试剂盒,已用于四川和重庆等15个县市田间与苗圃248个马铃薯显症或无症样品的实际检测,表明四川和重庆地区2~3种马铃薯病毒往往复合侵染(PVX、PVA和PVS三种病毒复合侵染或PLRV和PVY二种病毒复合侵染)。
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  利用内标为基础的RT-PCR技术检测草莓斑驳病毒

  杨洪一, 张志宏, 杜国栋, 代红艳, 高秀岩

  植物病理学报. 2005, 35(2): 116-122.

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  利用改进的CTAB法提取出优质的草莓总RNA,可以稳定地进行RT PCR。针对草莓斑驳病毒(SMoV)基因组序列设计筛选引物,对病毒基因组的不同区域进行扩增,扩增产物经克隆、测序证明为SMoV的特异片段,与国外序列的同源性为91%~97%。为了监测RNA的质量和RT PCR反应的正常进行,在检测体系中引入线粒体NADH脱氢酶基因ND2亚基作为内标,内标引物跨越内含子区域,只对剪接后的mRNA进行特异扩增,可以较好地监测整个检测过程。在国内首次建立了SMoV的RT PCR检测体系,以优质的草莓总RNA为模板,结合扩增内标的检测体系,对草莓病毒指示植物和草莓栽培品种都可以进行快速稳定的检测。
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  番茄细菌性溃疡病苗期接种新方法的研究

  罗来鑫, 李健强, Hasan BOLKAN

  植物病理学报. 2005, 35(2): 123-128.

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  在剪叶、浸根和针刺等细菌病害传统接种方法基础上设计了打顶接种新方法;以番茄细菌性溃疡病菌中国菌株和美国菌株借助打顶法接种佳粉10、合作908和华南红宝石3个国内主栽番茄品种2~3片真叶期幼苗,在昼夜最低、最高温度15~18℃、32~35℃和相对湿度为30%~60%的温室条件下,打顶法接种番茄幼苗后溃疡病发病率为87.5%~100.0%,病情指数随接种菌悬液浓度提高而增大,达到23.96~82.29,3个供试品种之间表现稳定一致;剪叶、浸根和针刺接种方法的发病率普遍在40%以下,病情指数在20以下,3个供试品种之间未表现明显差异;进一步研究显示,使用选择性培养基mSCM能够从打顶法接种后的发病植株上获得培养性状与原接种体一致的分离物,专化性免疫凝聚试剂盒检测到特定的测试线,PCR扩增到614bp的特异性条带,证实该分离物为番茄细菌性溃疡病菌,发病植株为接种体侵染所致。该研究结果表明,打顶接种方法比剪叶法、针刺法和浸根法更适合用于番茄溃疡病菌的致病性测定和评价不同番茄品种苗期的抗病性,具有应用价值。
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  卫星RNA SatC382对辅助病毒的影响

  覃玥, 陈集双, 金波

  植物病理学报. 2005, 35(2): 129-133.

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  通过体外转录将黄瓜花叶病毒(CMV)卫星RNASatC382与不带卫星的黄瓜花叶病毒CNa株系进行假重组,获取带卫星的CMV重组株(CNa-SatC382)。经dsRNA提取及RT PCR检测,证实CNa和SatC382在假重组株中能稳定共存。测定CNa和CNa-SatC382的14种寄主生物学反应,并统计两者接种昆诺藜、假酸浆、心叶烟、西葫芦7、14、21、28d的病情指数,结果显示:带卫星和不带卫星的CMV在各供试寄主上表现的症状差别不明显,病情指数也无显著差异。由此推测卫星RNASatC382没有改变辅助病毒CMV-CNa株系对寄主症状的影响。
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  根结线虫种群的线粒体DNA分析

  孙龙华, 廖金铃, 李迅东, 卓侃

  植物病理学报. 2005, 35(2): 134-140.

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  在同工酶和形态学鉴定的基础上,利用引物#C2F3和#1108对42个根结线虫种群线粒体DNA (mtDNA)中的COⅡ和LrRNA间区域进行特异性PCR扩增,35个种群的扩增产物约为1.7kb,其中29个是南方根结线虫,6个是爪哇根结线虫;3个花生根结线虫种群的扩增产物约为1.1kb;1个种群的扩增产物约为0.7kb,为根结线虫属在中国的新记录种;3个北方根结线虫种群的扩增产物约为0.5kb。用单条2龄幼虫提取物作模板得到的结果与大量提取DNA作模板的结果相同。为了区分产生相同大小片段的南方根结线虫和爪哇根结线虫,用限制性内切酶HinfⅠ对扩增产物进行酶切,结果表明:所有供试的南方根结线虫都可以被HinfⅠ酶切,且产生约1.3和0.4kb的2个限制性片段;但供试的爪哇根结线虫种群不能被酶切。由此表明,利用mtDNA PCR及酶切实验可以作为快速而准确地鉴定常见根结线虫的方法。
细胞生物学、生理学、生物化学、分子生物学
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  Alternaria alternata菌丝细胞壁凝集素的纯化与特性研究

  张成省, 李多川, 孔凡玉

  植物病理学报. 2005, 35(2): 141-147.

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  Alternaria alternata是接触性活体营养菌寄生真菌纤细齿梗孢Olpitrichum tenellum的寄主真菌之一,该寄生过程中菌寄生真菌与寄主真菌的识别机制未见报道。本文分离、纯化了A.alternata菌丝细胞壁上的一种参与识别作用的特异性蛋白——凝集素,并对其特性以及在菌寄生过程中的作用做了初步研究,粗提液经硫酸铵分级沉淀,DEAE-Sepharose阴离子交换柱层析和SephacrylS 100分子筛层析等步骤便可获得凝胶电泳均一的凝集素AAL,经凝胶过滤层析法测得分子量为37.2kDa,经糖染色鉴定为一种糖蛋白。孢子凝集试验表明,AAL对O.tenellum的孢子具有极强的凝集力,在含量为3 325μg/mL时,30min内90%的O.tenellum孢子发生凝集作用,对照(不含AAL的缓冲液)凝集力则显著下降。上述结果说明AAL在A.alternata细胞壁蛋白抽提液和O.tenellum的孢子吸附中扮演着重要角色,可能起识别因子的作用。
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  利用RNA介导的抗病性获得抗2种病毒的转基因烟草

  白庆荣, 朱俊华, 刘晓玲, 朱常香, 宋云枝, 温孚江

  植物病理学报. 2005, 35(2): 148-154.

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  RNA介导的病毒抗性(RMVR)是近年发展起来的一种新的植物抗病毒基因工程策略,具有抗病性强、抗性持久、生物安全性高等特点。利用该策略培育多抗病毒植株具有广阔的应用前景和重要的实践意义。本研究将非翻译的马铃薯X病毒的衣壳蛋白(PVX-CP)基因和非翻译的马铃薯Y病毒的衣壳蛋白(PVY-CP)基因组成嵌合基因,构建植物表达载体pROKXY,利用农杆菌介导法转化烟草NC89,获得6株对PVX和PVY的混合侵染表现为免疫的转基因植株。分子分析表明,这种抗性为RNA介导的病毒抗性。这一研究结果为利用RMVR进行植物多抗病毒育种提供了重要数据和资料。
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  表达的hrmA蛋白质具有诱导水稻细胞产生防卫反应的活性

  程志强, 吴学龙, 陈旭君, 李德葆, 郭泽建

  植物病理学报. 2005, 35(2): 155-160.

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  将丁香假单胞菌hrmA基因构建到原核表达载体pET 29中,得到重组载体pET hrmA。将重组载体转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,获得了以包含体形式存在的融合蛋白。复性的融合蛋白能诱导水稻悬浮细胞的活性氧迸发,处理20min后达到峰值。Northern杂交结果表明hrmA蛋白能显著地诱导PBZ1基因在水稻悬浮细胞中表达,在所观察的时间内PBZ1基因表达丰度随处理时间延长而增加,用hrmA处理水稻植株,诱导了PAL基因的表达。实验结果表明hrmA融合蛋白具有激活水稻细胞防卫反应的活性。
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  禾谷镰孢菌γ-微管蛋白基因克隆及其与多菌灵抗药性关系分析

  陈长军, 王建新, 周明国

  植物病理学报. 2005, 35(2): 161-167.

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  根据禾谷镰孢菌参考菌株NRRL31084(PH-1)的γ-微管蛋白基因核苷酸序列设计5对引物,采用PCR方法从禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)对多菌灵(MBC)的敏感菌株、室内诱导及田间多菌灵抗药性菌株中分段扩增测序,获得了γ-微管蛋白基因全序列。该基因全长1 868bp,含有5个内元,编码一含493aa的多肽;与PH 1的γ-微管蛋白基因核苷酸序列同源性99%,存在10个差异核苷酸,与所编码的氨基酸序列同源性100%;与其它7种真菌的γ-微管蛋白基因所编码的氨基酸序列同源性为31%~72%。中国的2个敏感菌株和4个抗药菌株的γ-微管蛋白基因序列完全相同,认为多菌灵抗药性与该微管蛋白变异无关。
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  疫霉蛋白激发子PB90对病原菌生长与致病力的影响

  张正光, 王源超, 郑小波

  植物病理学报. 2005, 35(2): 168-173.

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  激发子PB90是由棉疫病菌分泌的可诱发非寄主植物系统获得抗病性的一类新型蛋白激发子。本文就该激发子在棉疫病菌生长发育及致病过程中的作用进行了研究。采用胶体金标记发现该激发子主要分布在棉疫病菌的细胞壁上,该激发子可以分泌到细胞外;在离体条件下,PB90的多克隆抗体并不抑制棉疫病菌游动孢子的萌发和孢子萌发后形成菌落的能力,而且抗体包埋的游动孢子仍能激发非寄主植物烟草的过敏性坏死反应;但是,抗体的包埋处理可以使棉疫病菌的游动孢子丧失对棉花的致病力。结果表明,特异性存在于细胞壁上的疫霉蛋白激发子PB90是棉疫病菌的一种重要的毒性因子,在病菌对棉花的致病过程中具有重要作用;此外本研究结果还提示PB90并不是惟一能诱导非寄主烟草过敏性反应的棉疫病菌激发子,除了PB90之外,棉疫病菌还能产生其它的激发子诱导烟草的过敏性坏死反应。
致病性与抗病性遗传
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  抗玉米纹枯病材料的鉴定及抗性遗传研究

  杨俊品, 唐海涛, 杨家秀, 李晓, 陈德全, 张彪, 石永刚, 黄宜祥

  植物病理学报. 2005, 35(2): 174-178.

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  通过1997~2000年抗性鉴定,获得CML270为高抗玉米纹枯病且抗性稳定的抗性材料。该自交系在不同年份,对不同地理来源的玉米纹枯病强致病菌丝融合群AG 1 IA表现高抗(病情指数10左右),抗性表现明显优于国内玉米骨干自交系478和48-2。抗性遗传初步分析表明,玉米纹枯病抗性表现为质量-数量性状,抗性遗传受主效基因控制,同时受微效多基因修饰,最少基因数目4~7对。玉米纹枯病抗原的获得为最终解决玉米纹枯病危害提供了技术和材料支撑。
植物病害及其防治
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  绿色木霉菌T23对黄瓜枯萎病防治效果及其几种防御酶活性的影响

  庄敬华, 高增贵, 杨长城, 陈捷, 薛彩云, 牟连晓

  植物病理学报. 2005, 35(2): 179-183.

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  本文通过生物测定的方法初步研究了绿色木霉菌T23分生孢子和厚垣孢子对黄瓜枯萎病防治效果及黄瓜幼苗几种防御酶活性的影响。结果表明:黄瓜幼苗经木霉菌处理后,病情指数由33.69分别降至13.12和10.28,经木霉菌处理的黄瓜体内与抗性反应相关的苯丙氨酸解氨酶(PAL)、过氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)及过氧化氢酶(CAT)活性有明显增加,其峰值分别为对照的2.75、2.49、2.42及15.84倍,说明生物防治过程中可能有木质素、植保素等抗性物质的参与。与分生孢子处理相比,木霉菌厚垣孢子处理的酶活高峰出现得晚,但酶活峰值高。
研究简报
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  中国落叶松-杨栅锈菌(Melampsora laricipopulina Kleb.)生理小种分化

  曹支敏, 余仲东, 潘彦平, 任本权

  植物病理学报. 2005, 35(2): 184-186.

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  90年代末,作者首次对我国秦岭林区落叶松一杨栅锈菌的致病性及生理小种分化进行了研究,并初步将其划分为3个生理小种^[1]。2001~2003年,作者进一步对我国西北、华北、东北和西南的广大杨树种植地区的落叶松一杨栅锈菌致病性分化进行深入研究,证明该锈菌在全国范围内存在明显不同的5个致病类型,并将其划分为5个生理小种。
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  玉米灰斑病菌的遗传多样性研究

  王桂清, 高增贵, 唐树戈, 陈捷

  植物病理学报. 2005, 35(2): 187-189.

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  玉米灰斑病是由玉蜀黍尾孢菌(Cercospora zeae-maydis Tehon&Daniels)引起的世界性病害,近年来中国北方玉米发生较为严重。关于该病菌是否存在遗传变异现象在国内始终未见深人的报道,为此本研究通过RAPD技术,从DNA分子水平来研究玉米灰斑病菌群体内遗传变异的情况,为深入研究病菌致病性分化的机理和病菌一寄主互作的机理奠定基础。
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  佛手柑黄龙病发生初报

  贺红, 张桂芳, 潘超美, 黄海波, 林小桦

  植物病理学报. 2005, 35(2): 190-192.

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  佛手柑[Citrus medica vat.sarcodactylis(Noot.) Swingle]为芸香科柑桔属植物,其干燥果实入药,具有舒肝理气,和胃止痛的功效,为常用中药材。佛手柑在广东栽培历史悠久,主产于广东德庆、高要、云浮、四会和郁南等地,俗称"广佛手",以区别于"川佛手"和"金佛手",广佛手为广东道地药材,"十大广药"之一^[1]。