2008年, 第38卷, 第4期　刊出日期：2008-08-10

  

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病原学
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  甘蓝枯萎病病原菌的鉴定

  张扬, 郑建秋, 谢丙炎, 李健强, 吴学宏, 师迎春, 马永军

  植物病理学报. 2008, 38(4): 337-345.

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  采用温室接种致病性测定、形态学观察和分子鉴定方法对甘蓝枯萎病病原进行了研究。从北京市延庆县9个甘蓝生产基地采集甘蓝枯萎病病样96份,分离获得来自甘蓝病株根、短缩茎、叶片等器官的30个真菌分离物。经过致病性试验证实,分离物GLW3和GLW8为甘蓝枯萎病病原菌。经形态学鉴定,GLW3为尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum),GLW8为轮枝样镰刀菌(Fusarium verticillioides)。利用镰刀菌的核糖体DNA(rDNA)内转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)的保守性和变异性,分别采用真菌通用引物和镰刀菌属及轮枝样镰刀菌特异性引物对GLW3和GLW8进行PCR扩增,并将测序结果在GenBank中进行同源性比对分析,分子鉴定与形态学鉴定结果一致。轮枝样镰刀菌作为甘蓝枯萎病的病原菌系首次报道。
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  海南一品红细菌性叶斑病病原菌的分离与鉴定研究

  李斌, 王笑, 余山红, 徐丽慧, 张慧丽, 谢关林

  植物病理学报. 2008, 38(4): 346-351.

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  为明确海南省近几年发生的一品红细菌性叶部病害的病原菌特别是该病原菌的分子特征,为该病害的治理提供可行的依据,本文描述了2005年海南省部分花圃一品红植株上发生的细菌性叶斑病症状,并通过致病性测定、BIOLOG分析和16SrDNA序列比较将分离的病原菌鉴定为黄单胞菌属(Xanthomonas);部分碳源利用测定进一步显示2005年海南分离的菌株与2004年海南报道的细菌性疫病病原菌存在差异,但与杭州地区报道的一品红细菌性叶斑病菌基本一致。利用黄单胞菌模式种典型菌株的核糖体DNA内转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)序列构建系统发育树,结果显示3个海南菌株与巴豆黄单胞菌(Xanthomonas codiaei)和地毯草黄单胞菌(X.axonopodis)单独聚合成群,其中与巴豆黄单胞菌亲缘关系最近。
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  水稻瘤矮病毒广东分离物基因组第10组分的序列分析及原核表达

  赵芹, 阮小蕾, 陈秀, 刘福秀, 李华平

  植物病理学报. 2008, 38(4): 352-356.

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  应用RT-PCR技术克隆了水稻瘤矮病毒(Rice gall dwarf virus,RGDV)广东分离物基因组的第10片段,并测定了全序列。结果表明,RGDV广东分离物S10(登录号EF532325)全长1198bp,含有一个ORF,编码一条由320氨基酸组成、推测分子量约36kDa的多肽。与泰国分离物相应组分相比,基因结构基本一致,核苷酸和氨基酸序列同源性分别为96.2%和98.8%;S10编码多肽与水稻矮缩病毒(Rice dwarf virus,RDV)s9编码蛋白及伤瘤病毒(Wound tumor virus,WTV)S11编码蛋白也分别具有29%和33%的相似性。本研究还将S10cDNA克隆至原核表达载体pET28b(+)上,通过IPTG诱导在大肠杆菌BL21(DE3)中得到了高效表达,并利用His,Bind树脂纯化得到电泳纯级制品。本工作为进一步研究S10编码蛋白的结构与功能奠定了一定的基础。
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  基于外壳蛋白基因序列对3种葫芦科作物病毒的分子分析

  古勤生, 田延平, 彭斌, 刘丽锋, 邓丛良, 粱新苗, 孟娟

  植物病理学报. 2008, 38(4): 357-363.

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  从山西运城的南瓜(Cucurbita moschata)、河南开封和孟津的西葫芦(Cucurbita pepo)上通过ELISA分别检测到南瓜花叶病毒(Squash mosaic virus,SqMV)、西瓜花叶病毒(Watermelon mosaic virus,WMV)和番木瓜环斑病毒西瓜株系(Papaya ringspot virus-Watermelon type,PRSV.w),通过接种分离纯化获得其病毒毒原(CH99/211,CH99/113,CH99/69)。本研究克隆了这3个分离物的外壳蛋白基因,应用DNAStar、Clustal X、Phylip等分析软件将这些序列同已报道的相应序列进行分析并构建系统树。结果发现SqMV可以分为两个组,CH99/211分离物与美国的Arizona分离物接近,应属于z组;WMV分为两个组,CH99/69同国内黑龙江分离物(WMV-HLJ)和云南分离物(WMV-CHN)最接近,成一小簇;PRSV分成两个组。CH99/113属于Ⅱ组,与国内SP、MZ和BN分离物接近。序列分析表明PRSV和WMV在进化上具有地理相关性。SqMV和PRSV-W外壳蛋白基因序列分析属国内首次报道。
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  侵染曼陀罗的中国番茄黄化曲叶病毒及其卫星DNAβ全基因组结构特征

  丁铭, 杨程, 罗延青, 岳宁, 方琦, 苏晓霞, 张仲凯

  植物病理学报. 2008, 38(4): 364-369.

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  从云南大理曼陀罗上采集到病毒分离物YN72,症状表现为叶脉增厚、叶片褪绿、植株矮化。全序列测定表明,YN72DNA-A全长2739个核苷酸。基因组比较发现,YN72DNA-A与中国番茄黄化曲叶病毒分离物(TYLCCNV-[Y43])同源性最高(93.4%),与中国番茄黄化曲叶病毒烟草分离物(TYLCCNV-[Y5])的同源性次之(92.9%),而与亚洲地区的其它双生病毒的同源性均在90%以下,表明曼陀罗中的分离物YN72是TYLCCNV的1个分离物。利用WTGs卫星分子DNAβ的特异性引物beta01和beta02,在YN72中PCR扩增到DNAβ分子。序列分析表明,YN7213全长1335个核苷酸,在其互补链上编码1个有功能的ORF(C1)。YN72β的全序列与TYLCCNV分离物卫星分子Beanβ和Y297β的同源性最高,分别为99.8%和99.3%;与其它所比较的DNAβ的同源性均低于80.6%。系统进化树研究表明,YN72卫星分子DNAβ与其辅助病毒是共同进化的。
细胞生物学、生理学、生物化学、分子生物学
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  硼抑制灰霉病菌孢子萌发机制的初步研究

  黄芳, 王建明, 徐玉梅

  植物病理学报. 2008, 38(4): 370-376.

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  本文研究了硼对灰霉病菌孢子萌发的影响并对其抑制机理作了进一步的分析。用0.1%硼处理灰霉病菌孢子后,显著地抑制了孢子萌发和芽管伸长。与不处理的对照相比,0.1%硼使灰霉病菌孢子细胞内超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶(POD)的活性逐渐下降,还原型谷胱甘肽(GSH)和抗坏血酸(ASA)含量逐渐降低,丙二醛(MDA)、过氧化氢(H₂O₂)含量和超氧阴离子(O₂^·)产生速率上升。此外,DCHF-DA荧光染色结果也进一步证明硼处理造成了灰霉病菌孢子细胞内活性氧的积累。本试验结果初步表明,0.1%硼处理使细胞内活性氧清除系统破坏,膜脂过氧化作用加强,是抑制灰霉病菌孢子萌发和芽管伸长的重要原因。
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  生防芽孢杆菌T2胞外蛋白酶的纯化及其抗真菌作用

  邢介帅, 李然, 赵蕾, 梁元存, 竺晓平

  植物病理学报. 2008, 38(4): 377-381.

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  从小麦根际土壤中分离到一株高产蛋白酶并对棉花枯萎病菌(Fusarium oxysporum f sp.vasinfectum)具有拮抗作用的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)T2。采用硫酸铵分级沉淀、DEAE Sepharose Fast Flow、SP Sepharose Fast Flow离子交换层析、Sephadex G-75凝胶过滤层析,从T2发酵液中分离纯化出一种分子量约为29.0kD的蛋白酶。该酶作用的最适温度为65℃,最适pH为8.0,在低于50℃、pH5.0-7.5范围内较稳定。Na⁺、K⁺Pb²⁺、EDTA对酶有激活作用,Ca²⁺、Ba²⁺、Al³⁺、Zn²⁺、Mn²⁺、Hg²⁺、SDS对酶有部分抑制作用,而PMSF可完全抑制酶活,推测该酶是一种丝氨酸蛋白酶。抗菌活性显示,该酶对棉花枯萎病菌的孢子萌发、菌丝生长有明显抑制作用。
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  河北东部沿海地区野生大豆病毒病抗性与几种酶活性的关系

  史凤玉, 朱英波, 龙茹, 杨晴, 李海潮, 李桂兰, 乔亚科

  植物病理学报. 2008, 38(4): 382-387.

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  对来源于河北东部沿海地区的129份野生大豆进行抗大豆花叶病毒病鉴定。结果表明,2.3%的野生大豆抗大豆花叶病毒病,14.7%的野生大豆表现为中抗,26.4%的野生大豆表现为中间反应类型。选取11份不同抗性水平野生大豆进行生化指标的比较,相关分析表明,POD和SOD酶活性与野生大豆对病毒病的抗性无明显的相关性,而PPO和PAL活性与野生大豆对病毒病的抗性呈显著正相关,可利用PPO和PAL活性作为野生大豆病毒病抗性鉴定的参考指标。
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  南芥菜花叶病毒的几种PCR检测方法的建立和比较研究

  于翠, 杨翠云, 张舒亚, 乔艳艳

  植物病理学报. 2008, 38(4): 388-393.

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  以进境种球中截获的带毒洋水仙和郁金香为试验材料,建立了ArMV的免疫捕获RT-PCR、巢式PCR和Real-time PCR方法,并比较了几种检测方法的灵敏度。DAS-ELISA的检测灵敏度较低,为1mg洋水仙或10mg郁金香带毒种球,而各种PCR方法的灵敏度可高于DAS-ELISA 100倍以上,其中Real-time PCR检测的灵敏度最高,可从20ng洋水仙或2μg郁金香的带毒种球中检出ArMV。鉴于DAS-ELISA灵敏度较低,建议在用ELISA初筛时,如样品OD₄₀₅值与阴性对照OD₄₀₅值之比在2.0左右时需要再用分子方法加以确证,以防漏检。
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  油菜花叶病毒武汉株系基因组全序列分析

  晏立英, 许泽永, 陈坤荣

  植物病理学报. 2008, 38(4): 394-400.

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  油菜花叶病毒(Oilseed rape mosaic virus,ORMV)武汉株系(Wh)基因组全序列分析表明,该株系基因组全长6301nt,与烟草花叶病毒属(Tobamovirus)亚组Ⅲ病毒基因组结构相似,含4个开放阅读框架(open reading frame,ORF),ORF2与ORF3有77nt的重叠区。与该属其他病毒对应ORF的核苷酸及编码蛋白氨基酸序列比对,ORMV-Wh与亚组Ⅲ的ORMV、车前草花叶病毒上海株系(Ribgrass mosaic virus,RMV-Sh)、车前草花叶病毒凤仙花株系(RMV-Imp)和烟草花叶病毒十字花科和大蒜株系(Tobacco mosaic virus,TMV-Cg)一致性最高,均超过95%。4种蛋白的氨基酸序列系统进化树构建将Tobamovirus亚组Ⅲ株系分为3个群,ORMV-Wh归为ORMV代表的株系群。
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  榆树黄化病植原体的分子检测与鉴定

  朱天生, 潘一展, 崔廷涛, 高瑞, 李向东, 朱水芳

  植物病理学报. 2008, 38(4): 401-406.

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  利用植原体16SrRNA基因的通用引物R16rrLF2/R16mR1和R16F2n/R16R2对山东泰山上发生的榆树(Ulmus parvifolia)黄化病感病植株总DNA进行巢式PCR扩增,得到了约1.2kb的特异性片段,从分子水平证实了榆树黄化病的病原(EY-China)为植原体。将扩增到的片段测序,并进行一致性和系统进化树分析。结果表明,该分离物属于植原体榆树黄化组(Candidatus Phytoplasma ulmi),与该组成员16SrRNA序列的一致性均在98.2%以上,其中与16SrV-B亚组中的纸桑丛枝(Paper mulberry wiches'-broom)和枣疯病(Jujube witches'-broom)植原体一致性最高,达到99.4%,在系统进化树中与该亚组成员聚类到同一个分支,说明该分离物属于植原体16SrV-B亚组。本研究首次对在中国引致榆树黄化病的植原体进行了分子检测,并通过核酸序列分析将其鉴定到亚组水平。
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  河南郑州小麦禾谷孢囊线虫(Heterodera avenae)的核糖体基因ITS序列和RFLP分析

  欧师琪, 彭德良, 李玉, 王永江

  植物病理学报. 2008, 38(4): 407-413.

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  采用PCR技术对河南郑州禾谷孢囊线虫群体的核糖体基因(ribosomal DNA,rDNA)内转录间隔区(Internal Transcribed Spacers,ITS)进行扩增,获得片段长度约为1040bp。利用UPGMA方法分析了河南郑州禾谷孢囊线虫群体与近缘种的系统发育关系,结果表明:中国Heterodera avenae群体,H.australis和H.pratensis亲缘关系很近。8种限制性内切酶(Restriction Enzyme,RE)酶切禾谷孢囊线虫ITS的扩增产物,其中HindⅢ、AvaⅠ不能酶切PCR产物;Alu Ⅰ酶切PCR产物,获得560bp和480bp2个片段;RsaⅠ和Hinf Ⅱ酶切后分别得到3个片段(700、320、20bp和820、180、40bp);CfoⅠ是3个酶切位点(740、150、110、40bp);HaeⅢ和MvaⅠ能分别清晰地观察到3个片段(420、350、180bp和400、340、280bp),但有微小片段无法清晰观察到。9个种群所得RFLP图谱一致,说明郑州禾谷孢囊线虫群体可能是同一种群且不同于欧洲群体(typeA)和印度群体(typeB)的C型。
植物病害及其防治
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  姜瘟病菌拮抗放线菌的筛选与鉴定

  张成玲, 赵永强, 于晓庆, 张薇, 解永梅, 李向东, 张广民

  植物病理学报. 2008, 38(4): 414-419.

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  从山东各地区姜田随机采集土样30份,利用稀释分离法分离到放线菌菌株621株。采用琼脂移块法测定这些菌株对姜瘟病菌(Ralstonia solanacearum)的拈抗作用,共筛选出具有拮抗作用的放线菌菌株53株。选择抑菌活性最强的菌株Y7进行进一步研究。菌株Y7孢子丝顶端呈小螺旋形或钩状,孢子椭圆形至圆柱形。在5种供试培养基中,菌株Y7只在燕麦培养基上产生黄色色素。该菌株能利用麦芽糖、葡萄糖、果糖、L(+)树胶醛糖、半乳糖和山梨糖,不能利用蔗糖、木糖、肌醇、纤维二糖和山梨醇。形态特征、生理生化特征和16SrDNA序列分析结果表明,Y7为淡紫灰链霉菌(Streptomycetes lavendulae)。正交实验结果表明其最佳发酵条件是小米培养基pH7.0,28℃,培养14d。
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  二硫氰基甲烷及其分解产物对根结线虫幼虫作用方式的研究

  祁之秋, 陈长军, 王建新, 周明国

  植物病理学报. 2008, 38(4): 420-424.

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  二硫氰基甲烷及其分解产物对根结线虫二龄幼虫具有很高的生物学活性,LC₅₀和LC65分别为0.7220和1.6527μg/mL;1μg/mL二硫氰基甲烷处理二龄幼虫10min以上,二龄幼虫致病力下降;0.5μg/mL二硫氰基甲烷处理0~5min时,能增加线虫的呼吸作用,但随药剂处理时间延长(5min~12h),线虫呼吸作用受到抑制,2.5μg/mL二硫氰基甲烷对线虫呼吸的抑制作用高于0.5μg/mL;药剂处理的线虫悬浮液的电导率明显高于对照,且药剂浓度越高,悬浮液的电导率越大,这种变化在药剂处理的15~120min内保持稳定。
研究简报
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  五味子叶枯病病原菌鉴定

  刘博, 傅俊范, 周如军, 严雪瑞, 薛腾, 潘争艳

  植物病理学报. 2008, 38(4): 425-428.

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  The pathogen causing leaf blight on Schisandra chinensis (Turcz.) Baill. was isolated from diseased leaf. Based on morphological characteristics and pathogenicity test, the pathogen was identified as Alternaria tenuissima (Fr.) Wiltshire. This is the first report of this fungus infecting S. chinensis.
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  茄科蔬菜立枯丝核菌的融合群鉴定

  伍恩宇, 夏海波, 于金凤

  植物病理学报. 2008, 38(4): 429-432.

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  Sixty-five samples were collected from rhizosphere soil, hot pepper and tomato plants showing damping-off, root rot and stem rot in Taian, Shouguang of Shandong province and Zhouzhi, Taibai of Shaanxi province. Thirty-nine Rhizoctonia solani isolates were obtained from these samples. The results of anastomosis group (AG) identification and sequence analysis of 5.8S rDNA-ITS of the isolates showed that thirty-six isolates (92.3%) belonged to AG-4, while only three (7.7%) belonged to AG-5. The isolates of AG4 could further be divided into two subgroups of AG4-HG-Ⅰ and AG4-HG-Ⅲ. The 5.8S rDNA-ITS sequences of the selected isolates of the two subgroups had the 99%-100% identity with standard isolates of AG4-HG-Ⅰ and AG4-HG-Ⅲ (from GenBank). Among the analyzed isolates, AG4-HG-Ⅰ subgroup was the dominant with the frequency of 79.5%. Subgroup AG-4-HG-Ⅲ with the frequency of 12.8% was the second. This is the first report that subgroup AG4-HG-Ⅲ of R. solani isolated from Solanaceae vegetable crops in China.
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  苹果茎痘病毒新疆库尔勒香梨分离物运动蛋白基因的克隆与序列分析

  赵英, 牛建新

  植物病理学报. 2008, 38(4): 433-435.

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  Young leaves and shoot with Apple stem pitting virus (ASPV) detected by RT-PCR (reverse transcription-polymerase chain reaction) from Korla pear were used as materials and total RNA was extracted. Two expected fragments had been obtained by RT-PCR with two specific pairs of primers based on the sequence of NC_003462 published in GenBank. The specific fragments had been recovered and cloned, and the white colonies had been screened out. After enzyme digestion of the plasmids isolated, the positive clone was selected to be sequenced. Compared with NC_003462, three ORFs (open reading frame)-ORF2, ORF3 and ORF4 of ASPV with 673 bp, 365 bp, 276 bp representing homology of 77%, 88.52%, 86.33% respectively had been obtained.
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  应用MNP-RT-PCR方法检测黄瓜绿斑驳花叶病毒

  邓丛良, 江明, 汪万春, 聂棱, 梁新苗, 杨小霞, 高文娜, 吕玉峰

  植物病理学报. 2008, 38(4): 436-440.

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  A novel RT-PCR method integrated with Magnetic Nano Particles (MNP), MNP-RT-PCR, was set up for detection of Cucumber green mottle mosaic virus (CGMMV). After the virus particles in crude sap were concentrated by MNP, viral RNAs were released and were detected by RT-PCR. CGMMV could be detected in as less as 10 ng watermelon leaf materials. Compared with normal RT-PCR, the method decreased the inhibitors of plant material and steps for extracting RNA, and also increased the sensitivity of RT-PCR detection in less time. The method is simple and suitable for quick detection of plant virus in a large number of samples.
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  一些植物提取物的抗菌活性筛选

  张慧, 徐大高, 潘汝谦, 徐汉虹

  植物病理学报. 2008, 38(4): 441-444.

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  Methanol-extracts from nine plant species were screened for their bioactivity against Peronophythora litchii, Xanthomonas oryzae pv. oryzae and Ralstonia solanacearum. The plant extracts were applied on detached litchi young leaves before inoculation with sporangial suspension of P. litchii. The results showed that methanol extracts (at conc. of 100mg dry methanol extract weight per mL) of Hamamelis mollis and Derris scabricanlis possessed the highest antifungal activity against litchi downy blight with the inhibitory effectiveness of 88.89%, followed by Phryma leptostachya (77.78%), Clematis armcmdii (66.67%), and Daphniphyllum macropodum (61.11%). At the dose of lmg dry methanol extract weight, none of the tested plant methanol extracts showed inhibitory activities against X. oryzae pv. oryzae, whereas, H. mollis had the strongest antibacterial activity against R. solanacearum with the inhibitory zone diameter of 21 mm, followed by Aristolochia mollissima, D. macropodum, Pachyrhizus erosus, Vicia unijuga, and C. armcmdii with the inhibitory zone diameter between 9 to 11 mm.
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  棉花黄萎病拮抗细菌筛选与B-101菌株抗菌蛋白分离

  李术娜, 马平, 胡明, 袁洪水, 王世英, 朱宝成

  植物病理学报. 2008, 38(4): 445-448.

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  The antifungal proteins of antagonistic strains NCD-2, B-101, DHT-13, BDT-25, JJ-134, JJ-102 and 80b-2 isolated from the soil infected with Verticillium dahliae were obtained from their fermentation fil-trates through precipitation with 75% ammonium sulfate salting out. Antagonistic activities of the proteins were determined via cylinder-plate method. Results indicated that antifungal proteins from 80b-2, NCD-2, DHT-13 and B-101 had higher specific activity, of which B-101 and NCD-2 could produce clear inhibition zone. Antifungal protein of B-101 strain was obtained by using the salt fractionation. It was found that protein precipitated with 20%-30% saturation ammonium sulfate could produce transparent and bigger inhibition zone, thus it had obvious antifungal activity. Furthermore the antifungal protein was separated by DEAE-cellulose chromatography. An antifungal protein fraction named RFP-6 was obtained, which showed definite inhibition activity against Verticillium dahliae. Its molecular weight was approximately 14.4 kD as determined with SDS-PAGE.