2010年, 第40卷, 第5期　刊出日期：2010-10-10

  

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病原学
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  利用双重PCR-DHPLC技术检测水稻细菌性谷枯病菌的研究

  朱金国, 莫瑾, 朱水芳, 赵文军, 彭梓, 刘红霞, 钟文英

  植物病理学报. 2010, 40(5): 449-455.

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  本研究建立了一种应用双重PCR结合变性高效液相色谱技术(polymerase chain reaction-denatured high performance liquid chromatography,PCR-DHPLC)检测水稻细菌性谷枯病菌的方法。根据水稻细菌性谷枯病菌ITS序列(internal tran-scribed spacer)和gyrB基因序列,设计两对特异性PCR检测引物,对水稻细菌性谷枯病菌株和非水稻细菌性谷枯病菌株分别进行PCR-DHPLC及双重PCR-DHPLC检测,同时进行检测灵敏度及阳性菌株的同源性分析。结果显示,PCR-DHPLC检测的特异性强,灵敏度为菌浓度4×10² cfu/mL,7株水稻细菌性谷枯病菌PCR产物同源性一致。该方法能简便、灵敏、高特异性地对水稻细菌性谷枯病菌进行高通量的自动化检测。
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  应答调节蛋白基因flgRRxoo对水稻白叶枯病菌毒性表达的调控作用鉴定

  武晓丽, 吴茂森, 陈华民, 何晨阳

  植物病理学报. 2010, 40(5): 456-462.

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  为了阐明水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae,简称Xoo)应答调节蛋白FlgRRxoo的生物学功能,本研究通过基因克隆和序列分析、用标记交换法构建突变体以及表型测定,对flgRRxoo基因进行了分子鉴定。通过设计引物进行特异性扩增,成功地从Xoo野生型菌株PXO99^A中克隆了flgRRxoo。FlgRRxoo为N端具有REC结构域的单一结构应答调节蛋白,其基因序列与其他黄单胞病菌中的同源序列高度保守。与PXO99^A相比,△flgRRxoo胞外多糖(EPS)合成能力以及对水稻的毒性显著降低,基因互补可以使之恢复;△flgRRxooEPS合成基因gumBDGKM表达均有所下降;但其运动性、胞外纤维素酶和木聚糖酶活性无明显改变。表明FlgRRxoo可能主要通过调控EPS合成能力,影响了病菌在水稻上的毒性。
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  香蕉枯萎病菌1号和4号生理小种细胞壁降解酶的比较

  董章勇, 王琪, 秦世雯, 王振中

  植物病理学报. 2010, 40(5): 463-468.

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  对香蕉枯萎病菌1号和4号生理小种的细胞壁降解酶进行比较。通过测定4号生理小种在寄主体内细胞壁降解酶的活性发现,能检测到多聚半乳糖醛酸酶(PG)、果胶甲基半乳糖醛酸酶(PMG)、多聚半乳糖醛酸反式消除酶(PGTE)、果胶甲基反式消除酶(PMTE)和纤维素酶(Cx)的活性。在不同碳源培养条件下,2个生理小种均有以上5种酶的活性,以1%柑桔果胶为碳源时产生的PMG和PG活性明显高于其他几种酶的活性,而以1% CMC为碳源时,所产生的Cx都比其他几种酶的活性高。细胞壁降解酶同工酶电泳后发现,4号生理小种在寄主体内和体外培养时都比1号生理小种多分泌一种PG。2个生理小种在体外培养时分泌的PMG、PGTE和PMTE没有差异。4号生理小种在寄主体内比1号生理小种多分泌一种PMG,却少分泌一种PGTE,2个生理小种在寄主体内的PMTE则没有差异。
细胞生物学、生理学、生物化学、分子生物学
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  降解赤霉病菌毒素Tri101基因的原核表达及抗体制备

  闫海霞, 杨丽荣, 薛保国, 段立清, 孙虎, 全鑫

  植物病理学报. 2010, 40(5): 469-474.

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  采用RT-PCR方法克隆了编码禾谷镰刀菌单端孢酶烯3-O-乙酰转移酶Tri101基因的cDNA序列,并连接到原核表达载体pGEX-4T2上,将获得的重组载体pGEX-4T2/Tri101转化大肠杆菌BL21后用IPTG进行诱导表达。SDS-PAGE和Western blot分析表明,经IPTG诱导后,Tri101基因在大肠杆菌BL21中获得了高效表达,融合蛋白GST-Tri101分子量为75.45 kDa。将该融合蛋白切胶纯化后免疫家兔,制备兔抗GST-Tri101多克隆抗体。经ELISA法测定抗体效价大于1:256000。Western blot分析表明制备的抗体与原核细胞体外表达的Tri101蛋白可以特异性结合,表明该抗体的特异性良好。应用该抗体验证了感赤霉病小麦中Tri101基因的表达。兔抗GST-Tri101抗体的成功制备,为进一步研究Tri101的生物学功能、细胞定位以及在其它植物中的表达等奠定了基础。
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  百合斑驳病毒CP与CI基因的融合表达、多抗制备及其应用

  童勋章, 王亚军, 谢忠奎, 张玉宝, 安丽萍, 郭志鸿, 郭芳

  植物病理学报. 2010, 40(5): 475-481.

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  采用RT-PCR方法从甘肃地区引种的切花百合上克隆了百合斑驳病毒(Lily mottle virus,LMoV)的外壳蛋白(coatprotein,CP)基因与细胞质内含体(cytoplasmic inclusions,CI)基因的3'端600 bp片段,连接到原核表达载体pET-28a (+)上,构建了融合表达的重组质粒pET-28a-CP-CI200。重组质粒转化大肠杆菌BL21成功表达了融合蛋白CP-CI200。经镍柱亲和层析获得纯化的融合蛋白,进一步用其免疫家兔制备了多克隆抗体。Western Blot结果显示,该多抗与感染LMoV的百合叶片中的病毒CP与CI均发生特异性反应,而对健康百合叶片无反应。用该多抗建立双抗夹心酶联免疫吸附法(DAS-ELISA)检测百合叶片样品,相对于RT-PCR方法其灵敏度和特异性均达到了93.3%。研究结果为快速、准确检测百合斑驳病毒的试剂盒研制奠定了基础。
致病性与抗病性遗传
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  中粱93447抗条锈病基因遗传分析和分子作图

  杨悦, 马东方, 王文立, 宋建荣, 井金学

  植物病理学报. 2010, 40(5): 482-488.

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  用小麦条锈菌生理小种对中梁93447与感病品种铭贤169的杂交后代F₁、F₂和F₃代进行苗期温室抗条锈性遗传分析,结果表明中梁93447对CYR30的抗病性由1对显性基因控制。用中梁93447×铭贤169 F₂代分离群体建立抗、感DNA池,在F₂代群体中通过SSR标记技术寻找与抗病基因连锁的分子标记,发现7个位于5BS上的标记Xwmc813、Xwmc740、Xgwm159、Xbarc4、Xwmc616、Xwmc363和Xbarc89与目的基因连锁,遗传距离分别为17、12.9、8.3、4.5、3.7、9.1和20.8cM。系谱分析及分子标记分析表明,该基因可能来自中间偃麦草,暂命名为YrZL93447。与已定位于5B染色体上的抗条锈病基因的比较研究表明,YrZL93447可能是1个新的抗条锈病基因。用SSR引物BARC4和WMC616检测43个黄淮麦区主栽品种,其中7%的黄淮麦区主栽品种具有与YrZL93447基因相同的标记位点。
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  中国小麦贵州98-18中抗叶锈基因的分子定位

  陈现朝, 李星, 李在峰, 张海, 陈欢, 高敏, 刘大群

  植物病理学报. 2010, 40(5): 489-494.

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  小麦(Triticum aestivum)品系贵州98-18对中国目前大多数叶锈菌(Puccinia triticina)生理小种表现抗性。基因推导表明,贵州98-18可能携带新的抗叶锈基因。为了有效利用这一抗源,将贵州98-18和感病小麦品种郑州5389杂交,获得F₁、F₂代群体,用我国叶锈菌优势小种THTT对双亲及其杂交后代进行接种鉴定。结果表明,贵州98-18对THTT的抗性由1对显性基因控制,暂命名为LrG98。采用SSR技术对贵州98-18携带的抗病基因进行分子标记,共筛选了1274对SSR或STS引物,位于1BL染色体上的4对引物可在抗/感池和双亲中扩增出多态性DNA片段。遗传连锁分析结果表明,该抗病基因位于小麦1BL染色体上,与Xbarc582-1B和Lr26的STS标记ω-secali (Glu-B3)的遗传距离最近,均为3.8 cM。该基因与目前所有已知的抗叶锈基因不同,可能是1个新的抗病基因。
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  酸黄瓜南方根结线虫病抗性的解剖学及其细胞学研究

  叶德友, 王暄, 张燕霞, 钱春桃, 陈劲枫

  植物病理学报. 2010, 40(5): 495-503.

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  为探明酸黄瓜南方根结线虫病抗性的内在机理,以抗病材料酸黄瓜与感病材料北京截头为试材,对南方根结线虫侵入与幼虫发育、根的解剖学及线虫侵入诱导形成的取食位点的细胞学结构进行了比较研究。结果表明,抗病材料酸黄瓜根系中线虫侵入率极显著低于感病材料北京截头(P<0.01),酸黄瓜能够有效抵抗南方根结线虫的侵入;抗、感材料根系中雌雄虫个体比例分别为1:12和1:5(P<0.01),抗性反应能够抑制线虫取食和幼虫发育;酸黄瓜根的解剖结构与普通栽培黄瓜相似,酸黄瓜的根不具有结构抗性;抗病反应中细胞发生过敏性坏死,感病反应中无此类现象发生。抗侵入、抑制取食和坏死反应是抗病材料酸黄瓜抗性反应的主要特征。
流行学与生态学
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  应用real-time PCR定量检测小麦条锈菌潜伏侵染量方法的建立

  潘娟娟, 骆勇, 黄冲, 孙振宇, 赵磊, 闫佳会, 马占鸿

  植物病理学报. 2010, 40(5): 504-510.

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  小麦条锈病是我国小麦主要病害之一。快速、及时地诊断与定量监测处于潜育状态下的病叶,对准确估计越冬、越夏后的病情,制定正确的防治方案具有重要的意义。根据小麦条锈菌Puccinia striiformis的β-tubilin基因序列设计对该病原菌的种具有特异性的引物betaf/betar,并分别在普通PCR和real-time PCR扩增时对该引物的特异性和灵敏性进行了测定。结果表明该引物对小麦条锈菌特异性高,可稳定扩增出243 bp的目标条带。Real-time PCR的灵敏度为普通PCR的100倍。应用此特异性引物,建立了real-time PCR测定系统,定量测定了条锈菌在小麦叶片接种后组织内的DNA随时间的变化。结果表明,在接种后12 h,可在小麦叶片内检测到条锈菌,且条锈菌在小麦叶片内潜育期间随时间呈指数增长。接种第6 d后叶片内的菌量有明显的增加。建立的小麦条锈菌的real-time PCR早期定量测定方法,为及时、快速监测小麦条锈病在潜育期间的发病规律以及为该病的预测、防治提供依据。
植物病害及其防治
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  合欢叶提取物对油菜菌核病菌的抑制作用及其苗期防治效果

  刘峰, 代光辉, 周熙荣, 陈佳, 李会

  植物病理学报. 2010, 40(5): 511-516.

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  不同浓度的合欢叶提取物对油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)菌丝生长及菌核形成的抑制试验表明,该提取物具有抑制菌丝生长及菌核形成的作用,且随着浓度的提高活性增强,当浓度为20 mg/mL时,对菌丝生长的抑制率为73.1%,对菌核形成的抑制率为100%。通过对提取物处理后菌丝形态显微观察,发现病菌菌丝出现形态异常甚至断裂现象,且培养液电导率增加,推测为提取物处理后菌丝细胞壁破裂、细胞质外渗造成。苗期盆栽试验发现,该提取物对油菜菌核病菌有明显的防治效果,当浓度为20 mg/mL时,防治效果达72.1%。
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  鸭粪中1株水稻纹枯病菌拮抗细菌的鉴定

  张亚, 廖晓兰, 曾晓楠, 黄璜, 高文娟, 薛正杰

  植物病理学报. 2010, 40(5): 517-521.

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  为探索稻鸭复合生态系统抑制水稻纹枯病发生的作用机理,以从鸭粪中分离到的1株拮抗细菌A168对水稻纹枯病菌的拮抗效果进行了研究。测定了其对水稻纹枯病菌的拮抗作用及其抑菌谱;根据培养性状、形态特征、生理生化测定、扫描电镜观察及16S rDNA序列分析对其进行了鉴定;构建了包括其在内的13株相关种属菌株的系统发育树。A168菌株对水稻纹枯病有明显的拮抗作用,且对小麦赤霉病菌(Fusarium graminearum)、稻曲病菌(Ustilaginoidea virens)和油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)有抑制作用,抑菌谱广;A168菌体杆状,革兰氏染色阳性、芽孢中生、周生鞭毛、16S rDNA分析与其亲缘关系较近菌株Bacillus cereus (AJ577288.1)的同源性达99%,结合形态和生理生化特征,鉴定A168菌株为蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus),其16S rDNA序列已在GenBank中注册,登录号为GQ118339。A168为开发防治水稻纹枯病生防制剂提供了依据。
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  植原体16S rDNA RFLP指纹图谱分析软件研究

  牟海青, 赵文军, 邓中亮, 朱水芳

  植物病理学报. 2010, 40(5): 522-529.

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  植原体是一类寄生于植物韧皮部的原核生物。目前国际上主要根据植原体16S rDNA RFLP图谱的比对进行分类及鉴定。传统的PCR-RFLP试验步骤繁琐、重复性差,误差大,尤其在检测鉴定大量植原体病原时,耗时、耗力。通过对目前已公布的全部植原体16S rDNA序列进行比对整理,并生成16S rDNA RFLP电子指纹图谱库。在此基础上开发了指纹图谱分析软件DNA-FP Cluster1.0。该软件可基于序列或图谱形式进行比对,并自动输出比对结果。结果呈现形式为3种:即一种16S rDNA RFLP图谱与多种图谱间相似性分析;多种16S rDNA RFLP图谱间相似性分析;16S rDNA RFLP图谱间相似度树状图。该软件在不需要酶切试验操作的情况下实现了对植原体的快速分类与鉴定,并解决了因植原体材料不全而无法进行植原体酶切后比对的难题,为今后植原体候选种内的细化分类提供了方法与工具。
研究简报
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  荆芥茎枯病病原菌的分离与鉴定

  易茜茜, 张争, 丁万隆, 魏建和, 李勇

  植物病理学报. 2010, 40(5): 530-533.

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  The pathogen causing stem blight was isolated from diseased stem of Schizonepeta tenuifolia Briq.. Based on rDNA-ITS analysis, morphological characteristic and pathogenicity test, the pathogen was identified as Phytophthora nicotianae.
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  湖南水稻上1种新矮缩病的病原研究

  周倩, 高必达, 朱宏建, 陈欣怡, 梁晋刚

  植物病理学报. 2010, 40(5): 534-537.

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  Summer rice was suffered extensive damage from a new dwarf disease in Hunan Province in year 2009. In this study, the causal agent of this disease was confirmed as Southern rice black-streaked dwarf virus (SRBSDV) by nested RT-PCR, RT-PCR and PCR product sequencing.
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  稻曲病菌不同颜色厚垣孢子超微结构比较

  燕玮婷, 刘二明, 邓林伟, 黄红梅, 刘东波, 吕建林, 奉光平, 毛莹

  植物病理学报. 2010, 40(5): 538-542.

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  The surface and internal structure difference of yellow and black dormant chlamydospores of Ustilaginoidea virens on mid-and late-season rice were examined by scanning electron microscopy (SEM) and transmission electron microscopy (TEM). SEM revealed that the spherical yellow and black chlamydospores had prominent spines, with the diameters from 3 to 6 μm and 4 to 6 μm, respectively. The spines were 200-700 nm and 400-1 100 nm long in yellow and black chlamydospores, respectively. Variance analysis showed that there was no difference in diameter of the yellow chlamydospores but significant difference among the black ones collected from both rice cropping types. Similarly, there was no difference in length of the spines on the same color chlamydospores but extremely different between the yellow and black chlamydospores collected from the two cropping types. TEM revealed that the cell wall of both color chlamydospores were composed of two layers, the thick endosporium and thin exosporium, and the thickness of the former layer of the black chlamydospores was nearly two times as that of the yellow ones. The organelles in yellow chlamydospores such as the nucleus were obviously visible, but invisible in black ones. The cytoplasm of black chlamydospores was occupied by a big lipid globule. This study suggests that the formation of dormant chlamydospores of U. virens is related with the structural changes in the cell.
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  瞬时表达比较2种不同的RNAi载体的干涉效果

  邱礽, 陶刚, 邱又彬, 李奇科, 朱英, 迟胜起, 刘作易

  植物病理学报. 2010, 40(5): 543-547.

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  RNAi with natural defence mechanism of homologous RNA degradation is widely used in research of antiviral plant. It is important to construct a highly efficent RNAi vector for transgenic plants of virus resis-tance. In this study, part fragments of coat protein gene of Potato virus Y (PVY) (451-750 bp) were inserted into the two expression vectors. Vector pROKY300 without intron and pHelY300 with PDK and CAT introns on the hpRNA stem were constructed. The silence efficiency of virus resistance of the two vectors was investigated as 88% (22/25)for pROKY300 and 92% (23/25) for pHelY300 through transient expression mediated by agroinfiltration. The results showed that both vectors were highly antiviral and elucidated the validity of RNAi-medicates resistance to virus.
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  大麦黄矮病毒PAV株系的CP与GFP融合基因的构建和表达

  孙润红, 吴云锋, 张银武, 魏婷, 武科科, 赵震, 杨洋

  植物病理学报. 2010, 40(5): 548-551.

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  According to the published nucleotide sequences, CP gene of barley yellow dwarf virus PAV (BYDV-PAV) was synthesized by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR). The reporter gene GFP was put to the downstream of whole CP gene sequence of BYDV-PAV after double enzyme digestion, PCR identification and sequencing. The green fluorescence protein expression system of coat protein of BYDV-PAV was successfully constructed and expressed in Escherichia coli BL21 (DE3)plysS. The expression product was confirmed by SDS-PAGE, Western blot analysis and fluorescence microscope. The fusion gene CP-GFP was expressed in the range of 15-22℃, but could not be expressed at 23-37℃. The results provided a base for studying on BYDV-PAV movement in aphid further.
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  梨抗黑星病AFLP标记筛选

  董星光, 方成泉, 王斐, 王志刚, 樊丽, 林盛华

  植物病理学报. 2010, 40(5): 552-555.

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  Pear scab caused by Venturia nashicola is one of the most destructive diseases of pears. Molecular markers linked to scab resistance gene is expected to be useful for improving pear. In this study, the F₁ population derived from the cross of ‘Huangguan’ and ‘Yali’ was analyzed genetically. The resistance of pear to scab was proved to be controlled by a single gene in a dominant manner. Bulked segregant analysis (BSA) was conducted to screen 64 fluorescent AFLP primer pairs. A marker designated as D3-365 was found to be linked to the resistant locus. Selective genotype linkage analysis showed that the genetic distance between the marker and the resistant locus was 14.9 cM.
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  云南甘蔗宿根矮化病调查及种茎温水处理脱菌效果检测

  李文凤, 王晓燕, 黄应昆, 卢文洁, 罗志明

  植物病理学报. 2010, 40(5): 556-560.

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  Based on the specific primer from the nucleotide sequences between 16S-23S rDNA, Polymerase chain reaction (PCR) approach for detecting Leifsonia xyli subsp. xyli (Lxx) was established. The approach was applied to detect Lxx from 30 cultivars collected from two main sugar cane producing areas in Yunnan and 10 hot-water treatment samples. The results showed that 80% of the cultivars were infected by Lxx and hot-water treatment was proved to be an efficient measure to control but not completely eliminate Lxx in sugar cane tissues. The PCR products amplified from six infected cultivars were cloned and sequenced, six sequences were acquired and analyzed. It indicated that the six sequences were identical and showed 100% similarity with the isolates from Brazil, Australia and Fujian, and 99.54% with the isolate from Louisiana.