植物病理学报

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魏锋,余真真,商文静,杨家荣,徐向明,胡小平^*

植物病理学报. 2013, 43(5): 449-457.

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微菌核是大丽轮枝菌在土壤中的主要存活结构和黄萎病的初侵染来源。对土壤中大丽轮枝菌微菌核进行定量是黄萎病监测和预警的基础。本研究以大丽轮枝菌Internal Transcribed Spacer (ITS)区特异性引物对P1/P2扩增产物的重组质粒为标准品,构建SYBR Green I实时荧光定量PCR反应的标准曲线,结合土样水筛法建立了土壤大丽轮枝菌微菌核定量检测体系。同时,建立了土壤中微菌核数量与棉花黄萎病发病率的关系模型。结果表明,实时定量PCR检测灵敏度比常规PCR高10倍,检测下限为1个微菌核/克土,在5.54×10²～5.54×10⁷copies范围内,DNA拷贝数的对数值与Ct值具有良好的线性关系。建立的土壤中微菌核个数n与Ct值之间的关系为n=e^7.3-Ct/3.905。温室人工接种微菌核数量与棉花黄萎病发病率间的线性关系为y=2.710n+0.251。

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猕猴桃溃疡病菌的分子检测技术研究

邵宝林^,,刘瑶,朱天辉^*,李姝江

植物病理学报. 2013, 43(5): 458-466.

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猕猴桃溃疡病是猕猴桃生产上的主要病害,为建立该病的快速诊断技术,本实验通过RAPD分析获得一条1 300 bp左右的致病菌的特异片段,对该片段进行克隆测序,在测序的基础上设计并合成一对特异引物F7/R7,优化特异引物扩增条件,并验证引物的特异性和灵敏性。利用该特异引物对包括猕猴桃溃疡病菌在内的14个菌株基因组DNA进行PCR扩增表明,只有猕猴桃溃疡病菌能扩增出1条约为950 bp的特异条带,其他菌株及对照均未扩增出特异条带。对采自果园的染病枝干组织和接种致病菌的枝干组织的检测表明,该特异引物能特异性地检测到猕猴桃溃疡病菌的存在,其在组织中的检测灵敏度为100 fg/μL。因此,利用设计合成的特异引物F7/R7,参考优化的体系和程序,结合简单的试剂盒法提取猕猴桃溃疡病菌或植物组织DNA,可以在短时间内完成对该病原菌的分子检测。

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泡桐丛枝植原体pPaWBNy-1-ORF5编码蛋白的原核表达和抗体制备

耿显胜,田国忠,宋传生,胡佳续,林彩丽^*

植物病理学报. 2013, 43(5): 467-474.

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利用含泡桐丛枝植原体质粒pPaWBNy-1的3.0 kb片段的克隆为模板,PCR扩增pPaWBNy-1-ORF5的亲水性肽段编码区。目的片段连接到原核表达载体pET28a(+),重组质粒pET28a-ORF5-5转化大肠杆菌(Escherichia coli)Rosseta (DE3)感受态细胞,菌液处在对数生长期时(OD₆₀₀=0.52),添加IPTG诱导5 h后收集菌体,提取蛋白并进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。用六聚组氨酸标签抗体进行Western blot检测,发现分子量约为15 kDa的含多聚组氨酸标签的目的蛋白得到表达。切胶回收融合蛋白,免疫德国大白兔以制备抗血清,间接ELISA法测定抗血清的效价约为1∶8 100。用制备的ORF5编码蛋白的抗血清进行Western blot分析,结果在带菌的介体昆虫茶翅蝽(Halyomorpha halys)中检测到大小约为17 kDa的特异蛋白条带,但在健康和感病泡桐(Paulownia sp.)及无菌茶翅蝽中均未检测到,由此推测pPaWBNy-1-ORF5蛋白与介体昆虫传播植原体有关。

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H₂S位于H₂O₂下游介导葡萄抗霜霉病过程

王文杰,车永梅,郭秀萍,侯丽霞,刘新^*

植物病理学报. 2013, 43(5): 475-485.

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以霜霉病抗性葡萄品种左优红和感病品种霞多丽为材料,研究硫化氢(H₂S)在葡萄应答霜霉病过程中的作用及其与过氧化氢(H₂O₂)的相互关系。结果表明,接种霜霉病菌后,抗性品种左优红和感病品种霞多丽叶片均出现H₂S含量的猝发、H₂S合成酶基因表达量增加、抗病相关蛋白多酚氧化酶(PPO)和β-1,3葡聚糖酶(Glu)活性显著升高现象;且H₂S清除剂次牛磺酸(HT)可以显著抑制霜霉病菌诱导的PPO和Glu活性升高,并导致葡萄的感病率和病情指数显著升高;同时外源H₂S可降低两个葡萄品种的感病率和病情指数。说明,H₂S是参与葡萄抗霜霉病过程的新的信号物质。受霜霉病菌侵染后,葡萄叶片H₂O₂含量猝发早于H₂S,并且H₂O₂清除剂抗坏血酸(AsA)可显著抑制霜霉病菌所诱导的H₂S含量的上升,而H₂S清除剂HT对霜霉病菌诱导的H₂O₂含量变化影响不显著,推测,H₂S作用于H₂O₂的下游参与葡萄抵御霜霉病过程。

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条锈菌诱导的小麦EF手钙离子绑定蛋白基因TaCab1的功能初步分析

冯浩,黄雪玲,王晓敏,李华一,康振生^*

植物病理学报. 2013, 43(5): 486-494.

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根据小麦EF手钙离子绑定蛋白(TaCab1)基因序列,利用WMD3软件设计特异的人工miRNA (amiRNA),构建VIGS沉默载体。利用amiRNA-VIGS体系,对小麦的TaCab1基因的功能进行了初步分析。利用Northern blot和实时定量PCR技术分别检测了amiRNA的积累及TaCab1的沉默效率,并利用显微观察技术统计条锈菌侵染小麦后的组织学差异。结果表明,amiRNA可以得到有效的积累,其靶标基因TaCab1可以得到有效的沉默。从表型上看,小麦叶片上条锈菌夏孢子的产孢量也在一定程度上有所降低。组织学观察发现当TaCab1被沉默后,寄主细胞的坏死面积在侵染后期明显增大,条锈菌的菌丝分枝数也明显增多,但菌丝长度明显变短。

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瓜类褪绿黄化病毒外壳蛋白基因在大肠杆菌中的表达及抗血清的制备

施艳,袁媛,孙虎^*,古勤生,刘珊珊,王振跃^*

植物病理学报. 2013, 43(5): 495-499.

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根据已报道的瓜类褪绿黄化病毒(Cucurbit chlorotic yellows virus, CCYV)外壳蛋白(CP)基因的核苷酸序列设计引物,利用RT-PCR方法从感病甜瓜中扩增得到长度为753 bp的CP基因,将其克隆到原核表达载体pGEX-4T-3上,获得重组载体pGexCP,在大肠杆菌BL21菌株中诱导表达,SDS-PAGE分析表明,经IPTG诱导,CP基因在大肠杆菌BL21中得到了高效表达。以表达的蛋白为抗原,免疫家兔,制备了CCYV外壳蛋白的特异性抗血清。ACP-ELISA检测结果表明,当CP蛋白浓度为2.5 μg/mL时,血清效价高达5.12×10⁵。Western blot分析表明制备的抗体检测CCYV侵染的甜瓜叶片得到特异性的条带,表明该抗体的特异性较好。ACP-ELISA检测结果表明,制备的抗血清可用于田间甜瓜病样的检测。本试验为CCYV的快速检测提供了重要的研究材料。

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大豆根腐病原镰孢菌种群多样性DGGE分析及其致病性研究

魏巍^,,许艳丽^*,张思佳^,,S.Li

植物病理学报. 2013, 43(5): 500-508.

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应用变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术以及主成分分析方法,结合植物病原菌传统分离、鉴定及致病力测定,检测位于黑龙江省海伦市大豆连作定位试验区根腐病原镰孢菌的种群构成及其致病力。采用真菌传统分离和鉴定方法共确定镰孢菌6个种,包括燕麦镰孢Fusarium avenaceum、木贼镰孢F. equiseti、禾谷镰孢F. graminearum、腐皮镰孢F. solani、尖镰孢F. oxysporum和拟轮枝镰孢F. verticillioides。其中,尖镰孢菌的分离频率最高,为56.7%。结合DGGE条带克隆测序及系统发育分析鉴定出8种镰孢菌,较传统方法增加了黄色镰孢F. culmorum和一个尖镰孢近似种。同时,DGGE图谱中尖镰孢所占百分比下降为37.4%。采用主成分分析方法将大豆生育指标相关的多种变量进行降维分析,得到第一主成分贡献值为91.2%。按照贡献值的正负结果,将30株镰孢菌分为致病和非致病类群。第二主成分贡献值为5.8%,根据其正负值可以矫正被错误估计的致病能力。综合所有研究结果,该定位试验区大豆根腐病主要病原镰孢菌为尖镰孢、禾谷镰孢和燕麦镰孢,且以尖镰孢菌为优势病原菌。

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产生几丁质酶的交枝顶孢(Acremonium implicatum)对南方根结线虫生防潜力

林森,武侠^*,曹君正,王凤龙

植物病理学报. 2013, 43(5): 509-517.

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由于化学杀线剂给环境带来了污染问题,寄生线虫的生防真菌成为研究热点。为进一步鉴定和筛选高效食线虫真菌,从山东日照五莲烟草北方根结线虫卵中分离到1株较高应用潜力菌株WLE1。根据形态学和rDNA-ITS序列分析方法鉴定该菌为交枝顶孢Acremonium implicatum。该菌是1株能够产生几丁质酶的食线虫真菌,在第4天几丁质酶活性到达高峰,为18.49 μmol·h^-1·mL^-1 ,直到第16天依然维持较高活性;活性电泳测定其几丁质酶分子量分别为98.0、82.9、70.2和35.9 kDa;交枝顶孢几丁质粗酶液处理南方根结线虫卵,第7天卵的孵化抑制率为80.17%。该菌能够寄生南方根结线虫卵、2龄幼虫和雌虫。第6天卵和2龄幼虫的寄生率分别为82.11%和73.97%。说明具有高效产生几丁质酶特性且能寄生南方根结线虫不同生活史阶段的交枝顶孢WLE1对南方根结线虫具有巨大生防潜力。

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青枯雷尔氏菌无致病力突变菌株的构建及其防效评价模型分析

郑雪芳^,,刘波^*,林乃铨^*,朱育菁,车建美

植物病理学报. 2013, 43(5): 518-531.

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利用青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)无致病力菌株防治番茄青枯病具有很好的应用潜力。作者通过分离筛选自然弱毒株、⁶⁰Co辐射诱变和EZ-Tn5插入诱变,分别获得3、12和40株青枯雷尔氏菌无致病力突变菌株。经盆栽番茄苗致病性检测,15 d后均未发病,证实均为无致病力青枯雷尔氏菌。进一步对番茄青枯病的防治试验表明,从番茄青枯病发病田块分离的无致病力突变菌株FJAT1458的防治效果最好,防效达100%。该菌株能定殖番茄植株根系土壤、根部和茎部,定殖数量均表现为“先增后减”的趋势,并且接种浓度越大、苗龄越小,定殖数量越大。从构建的防效模型可以看出,不同接种浓度条件下,植株发病率随时间变化符合的回归方程不同,相关系数R值也不同,接种浓度越大,R值越小。本研究获得的青枯雷尔氏菌无致病力突变菌株FJAT1458对番茄青枯病具有很好的防病效果。

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赣南脐橙绿霉病菌对常用杀菌剂抗性监测

王明爽,孙颖,陈国庆,方贻文,夏长秀,李红叶^*

植物病理学报. 2013, 43(5): 532-540.

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本文研究了来自赣南7个县的柑橘绿霉病菌(Penicillium digitatum)种群对该地区常用杀菌剂抑霉唑、咪鲜胺、甲基硫菌灵和百可得的抗性频率、抗性水平和对抑霉唑的抗性分子机制。结果表明:病菌对抑霉唑和咪鲜胺存在基本一致的抗性;2011和2012年病菌种群对抑霉唑和咪鲜胺的抗性频率分别为82%和90%,平均抗性倍数为51.5倍,抗性分子机制均属于IMZ-R3,即CYP51B基因启动子区发生199 bp插入的突变;病菌种群对甲基硫菌灵的抗性频率分别为82%和91%;病菌种群对百可得均表现敏感。本研究为采后柑橘病害防治药剂选择提供了科学的依据。

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苹果轮纹病菌对苯醚甲环唑和氟硅唑的敏感性及其交互抗性

刘保友,张伟,栾炳辉,王培松,王英姿^*

植物病理学报. 2013, 43(5): 541-548.

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为明确苹果轮纹病菌对苯醚甲环唑和氟硅唑的敏感性状况,本研究采用菌丝生长速率法检测了90个采自山东省各地区的苹果轮纹病菌对苯醚甲环唑和氟硅唑的敏感性。实验结果表明,苯醚甲环唑和氟硅唑对轮纹病菌的EC₅₀平均值分别为0.198 1±0.247 1 μg·mL^-1和0.117 4±0.121 8 μg·mL^-1。频次分布图显示,苹果轮纹病菌群体中出现了敏感性降低的亚群体。三唑类杀菌剂苯醚甲环唑、氟硅唑和戊唑醇之间具有交互抗性;而三唑类杀菌剂苯醚甲环唑、氟硅唑、戊唑醇与代森锰锌之间不存在交互抗性。田间试验结果表明,苯醚甲环唑和氟硅唑对高敏感性和低敏感性病菌引起的枝干轮纹病具有同等的防治效果。本研究结果为田间防控苹果轮纹病的杀菌剂合理轮换使用提供了理论依据。

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啶菌口恶唑Z、E异构体的拆分及其抑菌活性比较

黄娅蓝,宁明宇,刘鹏飞^*,黄中乔,刘君丽,刘西莉

植物病理学报. 2013, 43(5): 549-555.

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啶菌口恶唑是一个新型异口恶唑类广谱杀菌剂,为探索其异构体的抑菌活性差异,采用薄层层析、柱层析和高效液相色谱法对啶菌口恶唑顺反异构体进行了分离和纯度检测,并测定了其对担子菌门、子囊菌门和无性型真菌类14个属16株植物病原真菌的离体活性。试验分离获得了纯度分别为94.9%和95.0%的啶菌口恶唑Z、E异构体。离体条件下,Z异构体对供试病原真菌EC₅₀值范围为0.000 2～0.730 3 μg/mL,E异构体EC₅₀值范围为0.003 1～49.182 7 μg/mL,Z异构体对14株病原菌抑菌活性显著(P＜0.01)高于E异构体。

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大豆花叶病毒诱导的应用于膜蛋白酵母双杂交的大豆cDNA文库构建

崔晓艳,陈新^*,栾鹤翔,智海剑^*

植物病理学报. 2013, 43(5): 556-560.

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2013年, 第43卷, 第5期　刊出日期：2013-09-30

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