2014年, 第44卷, 第3期　刊出日期：2014-06-30

  

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病原学
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  水稻新病害叶鞘黑斑病的病原鉴定

  黄 微， 夏 花， 高必达

  植物病理学报. 2014, 44(3): 225-231.

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  2011年7月，在湖南省花垣县水稻上发现一种新的病害，症状表现为叶鞘上出现长椭圆形黑斑，病健交界模糊。分离到的4隔孢弯孢霉(HNHY001)经离体和活体人工接种均可产生黑斑;另一种黑孢霉菌株(HNHY002)不引致叶鞘黑斑。从湖南省栽培水稻150份种子样本中共分离到弯孢霉菌株27个，其中4个菌株具有4隔孢子。这4个菌株中1个菌株不产生子座，其余3个均产生分枝子座。经人工接种除不产生子座的外，其余3个菌株均能产生典型的叶鞘黑斑。HNHY001的rDNA-ITS序列(GenBank登录号JQ360963)经BLAST搜索，与之最接近的几个序列为膝曲旋孢腔菌(Cochliobolus geniculatus)及其有丝分裂产孢种—4隔孢弯孢霉。鉴于单独以及与其它4隔孢弯孢霉菌株进行对峙培养均未产生有性阶段，建议根据此菌无性阶段特征即分生孢子较直、4横隔、子座分枝等特征，鉴定为膝曲旋孢腔菌有丝分裂产孢种之一的假弯孢(C.fallax)。水稻叶鞘黑斑病系国内外首次报道。
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  一个用于鉴定十字花科黑腐病菌Ⅲ型效应物分泌与转运的报告质粒的构建

  成春燕，杨威，甘永亮，蒋国凤， 杨丽超，阳丽艳，姜伯乐

  植物病理学报. 2014, 44(3): 232-238.

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  通过免疫检测的方法鉴定十字花科黑腐病菌(Xcc)Ⅲ型效应物的分泌和转运，将cyaA基因克隆至带有3×FLAG的pJXG载体上，构建带有3×FLAG和cyaA基因的报告质粒pJAA，并用已鉴定为Ⅲ型效应物的XC_1553启动子区信号区验证该报告质粒。将pJAA1553三亲导入Xcc 8004^*和8004^*ΔhrcV，然后通过Western blotting免疫检测XC_1553的分泌，结果在8004^*/pJAA1553的胞外蛋白中检测到了XC_1553的分泌，而在8004^*ΔhrcV/pJAA1553的胞外蛋白中没有检测到XC_1553的分泌。通过免疫反应定量检测8004^*/pJAA1553和8004^*ΔhrcV/pJAA1553侵染后植物体内的cAMP含量，结果发现8004^*/pJAA1553侵染后植物体内的cAMP含量比8004^*ΔhrcV/pJAA1553侵染后植物体内的cAMP含量高15倍。结果表明，报告质粒pJAA能够应用于鉴定十字花科黑腐病菌的Ⅲ型效应物。
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  稻瘟病菌MoCOS1基因调控MoCMR1基因表达的研究

  韩秀秀，李晓宇，何朝族

  植物病理学报. 2014, 44(3): 239-246.

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  以往研究证明MoCOS1可能是一个新型的转录因子，其突变体不产生分生孢子，黑色素合成明显减少。经过RNA-Seq分析，发现受MoCOS1调控的基因达到442个，其中MoCMR1的表达水平受到MoCOS1的下调。本研究中通过实时定量PCR进一步证实MoCOS1基因突变导致MoCMR1基因表达水平下降。基因MoCMR1突变后，黑色素产量略有减少，但分生孢子形态及产量和MoCOS1的表达量没有发生变化。
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  稻瘟病菌一假定几丁质酶多克隆抗体的制备及其检测

  吴丽民， 连永乐， 王宗华， 汪世华， 鲁国东

  植物病理学报. 2014, 44(3): 247-253.

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  为检测几丁质酶的表达，制备稻瘟病菌的一假定几丁质酶多克隆抗体，探索其可能运用。将稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae) 几丁质酶基因克隆入融合表达载体pET\|32a，并在大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)中进行诱导表达。表达菌株经0.5 mmol/L IPTG诱导4～6 h后，用Ni²⁺\|NTA亲和柱纯化蛋白，得到可溶的几丁质酶\|His融合蛋白。以该融合蛋白免疫新西兰雄兔，制备多克隆抗体。ELISA分析表明该抗体效价达1∶204 800，特异性良好。用该抗体ELISA检测了稻瘟病菌4个不同田间菌株中，不同的菌株表达量不同。对稻瘟病菌侵染水稻3、5和7d后的病叶进行抗原Western验证，结果表明，稻瘟病菌不同的侵染时间其几丁质酶表达量有明显差异。 几丁质酶表达的差异是否与菌株间致病型等生物学和生理学差异有关，目前正在进一步研究。
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  大丽轮枝菌蛋白激发子PevD1诱导棉花抗病性及作用机理

  卜冰武，邱德文，曾洪梅，郭立华，袁京京，杨秀芬

  植物病理学报. 2014, 44(3): 254-264.

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  PevD1是一种大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)分泌蛋白，具有激发烟草过敏反应(HR)和系统获得性抗病(SAR)的功能。为明确蛋白PevD1诱导棉花抗病性及其作用机制，本文利用大肠杆菌表达、纯化的PevD1诱导棉苗植株，检测棉苗对大丽轮枝菌的抗性及免疫应答反应。结果表明，大肠杆菌表达的PevD1重组蛋白不是棉花品种“新陆早42号”的致萎因子，叶片注射8 μg/mL PevD1蛋白诱导3 d后根部接种大丽轮枝菌，15 d后PevD1处理组病害减轻率达35.04%。PevD1能诱导棉花叶片抗性早期信号分子H₂O₂产生和NO积累，维管束细胞壁加厚、木质素和酚类物质的积累。另外，PevD1处理能提高防御酶PAL、POD和PPO活性，提高棉花抗性基因和木质素合成相关基因PAL、C4H1、4CL的转录水平。说明PevD1通过激发棉花免疫系统而提高抗病性，该研究不仅为利用PevD1蛋白激发子控制棉花黄萎病提供了科学依据，同时也为阐明棉花与大丽轮枝菌互作机理提供了理论基础。
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  玉米纹枯病菌细胞核纯化与原生质体转化的探讨

  张眉， 周善跃， 陈旭君， 李宝笃， 郭泽建

  植物病理学报. 2014, 44(3): 265-275.

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  引起玉米纹枯病的立枯丝核菌(Rhizoctonia solani Kühn)多为多核杂核真菌，也难以通过有性态使其细胞核进行单一化。利用原生质体再生的方法对单核玉米纹枯病菌JN的细胞核进行同核纯化，比较从单个原生质体再生菌获得的rDNA\|ITS序列，发现序列间存在差异，说明其细胞核没有达到预期纯化的效果。继而扩增了双核和多核玉米纹枯病菌的rDNA\|ITS序列，发现它们自身的rDNA\|ITS序列也存在差异，因此认为立枯丝核菌的这种rDNA\|ITS序列的差异可能是长期未经过有性阶段的结果且与其细胞核数目无关。使用转化丝状真菌的载体转化纹枯菌未获得稳定的转化子，进而对载体进行了改造，用纹枯菌(AG\|3)actin基因的启动子和终止子控制潮霉素基因构建了载体pRsA。利用PEG介导的原生质体转化方法，实现了对单核纹枯菌的转化，PCR验证得到3个转化子。但在PDA培养基连续继代5代后，转化子的潮霉素抗性消失。结果对改进纹枯菌的转化方法有借鉴意义。
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  水稻黑条矮缩病毒和水稻条纹叶枯病毒侵染下水稻qRT\|PCR内参基因的筛选

  沈江锋， 李俊敏， 孙丽英， 陈剑平

  植物病理学报. 2014, 44(3): 276-286.

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  病毒侵染通常会干扰寄主细胞的生理代谢过程，分析病毒侵染后寄主基因的表达差异，将为病毒与寄主之间的互作研究提供重要的分子基础。实时荧光定量PCR(qRT\|PCR)是目前基因表达分析中应用最广泛的方法之一，选择合适的内参基因对实验进行校正和标准化至关重要。但是，一些常用作内参的看家基因会受到病毒侵染的影响。本研究中，以感染水稻黑条矮缩病毒(Rice black\|streaked dwarf virus，RBSDV)和水稻条纹叶枯病毒(Rice stripe virus，RSV)的水稻总RNA为材料，利用qRT\|PCR技术和3个统计学软件探讨了10个常用内参基因在病毒侵染下的稳定性。结果显示，感染RBSDV和RSV水稻中表达最稳定的都是UBC和β\|TUB。因此，可选用UBC和β\|TUB组合作为分析RBSDV和RSV侵染过程的水稻内参基因。
致病性与抗病性遗传
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  大丽轮枝菌侵染抗感棉种的组织学过程观察

  肖红利, 孔志强, 包郁明, 赵凤轩, 柳少燕, 李 蕾, 陈捷胤, 戴小枫

  植物病理学报. 2014, 44(3): 287-294.

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  棉花黄萎病是一种极难防治的土传性真菌病害，研究病原菌侵染棉花的组织学过程对致病机理解析和抗病资源利用具有重要意义。本研究利用绿色荧光蛋白标记的大丽轮枝菌系统研究了其对抗病棉种海岛棉7124和三裂棉、感病棉种军棉1号和戴维逊棉的侵染过程。结果表明，大丽轮枝菌对抗/感棉种的初始侵染没有明显差异，接菌5 h后，分生孢子均能吸附在感病和抗病棉种的根表面。但侵染过程存在显著差异，侵染感病棉种中病原菌3~5 d到达皮层，5~7 d达到维管束，随后迅速扩展繁殖，侵染14 d后即完成系统侵染，并开始产生黄萎病症状;而病原菌侵染抗病棉种，5~7 d才侵入皮层，7~10 d到达维管束，14 d后仍无法扩展，病原菌的定殖与发展受到限制，无法形成系统侵染，较少形成黄萎病症状。本研究通过绿色荧光蛋白标记大丽轮枝菌对抗/感棉种的侵染过程研究，为大丽轮枝菌致病机理研究和抗性资源利用提供了强有力的理论依据。
流行学与生态学
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  应用多重PCR技术同步检测柑橘4种重要嫁接传播病原

  刘金香， 周常勇， 唐科志， 李玲娣， 刘科宏， 田 晓， 李中安

  植物病理学报. 2014, 44(3): 295-301.

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  柑橘衰退病毒(Citrus tristeza virus，CTV)，柑橘碎叶病毒(Citrus tatter\|leaf virus，CTLV)，柑橘裂皮病类病毒(Citrus exocortis viroid，CEVd)和柑橘黄龙病(Huanglongbing， HLB)亚洲种病原(Candidatus liberobacter asiaticus)是重要的柑橘嫁接传播病原。本文建立了同时检测HLB病菌、CTV、CEVd 和CTLV 4种柑橘嫁接病原的一步法、双温多重PCR检测技术体系，同时在体系中设置内参基因。应用该体系快速评价了4种嫁接传播病原在田间侵染情况，结果表明28个田间样品CTV、CEVd、CTLV和HLB感染率分别为89.3 %、17.9 %、10.7 %和28.6 %，接近半数样品为混合感染。并且将该方法应用于快速评价茎尖嫁接苗病毒的脱除情况。
植物病害及其防治
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  葡萄霜霉病菌对甲霜灵抗药性治理及其田间抗药菌株遗传稳定性分析

  毕秋艳， 马志强， 韩秀英， 张小风， 王文桥， 赵建江

  植物病理学报. 2014, 44(3): 302-308.

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  为了明确葡萄霜霉病菌对甲霜灵的田间抗药性水平发展态势，于轮换用药前后，采用叶盘漂浮法测定了河北、山西、河南3省葡萄主要种植区11个葡萄园试验地葡萄霜霉病菌对甲霜灵敏感性变化动态。结果表明:田间采集的葡萄霜霉病菌对甲霜灵抗药的菌株其抗药性可以稳定遗传;不同地区轮换用药后，葡萄霜霉病菌对甲霜灵的抗药水平变化态势因用药流程的不同而发生相应的变化。采用不同作用机制的杀菌剂轮换或混合用药进行葡萄霜霉病菌对甲霜灵的抗药性治理时，需制定合理的施药流程，并根据抗药性治理的效果不断完善治理措施。
研究简报
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  进境日本罗汉松上可可花瘿病菌的截获鉴定

  段维军， 郭立新， 段丽君

  植物病理学报. 2014, 44(3): 309-312.

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  目前，该病菌已被列入我国进境植物检疫性有害生物名录，是一种检疫性植物病原真菌。该病菌分布广泛，侵染可可造成癌肿病，严重时可导致可可绝收\[2\]，也能够引起多种植物顶枯病的发生，在日本有该菌造成释迦顶枯病的报道\[3\]。2013年3月，宁波检验检疫局从日本进境罗汉松种苗上分离到一株疑似可可花瘿病菌的分离物，通过形态学特征观察、致病性测定和序列比对分析，对其进行了鉴定，现报道如下。
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  进境韩国大花蕙兰上唐菖蒲伯克氏菌的分离鉴定及生物学研究

  厉 艳， 甘琴华， 封立平， 邵秀岭

  植物病理学报. 2014, 44(3): 313-317.

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  大花蕙兰（Cymbidium hybridum），又名虎头兰、喜姆比兰，兰科、兰属多年生草本植物，是近几年我国花卉市场上流行的高档室内盆栽花卉。大花蕙兰的杂交育种已有一百多年的历史，每年新增加的品种有几十种之多。近年来，我国检验检疫部门分别从各入境口岸的进境大花蕙兰中多次发现携带有菊基腐病菌（Erwinia chrysanthemi）、兰花细菌性褐腐病菌（Erwinia cypripedii）、建兰花叶病毒（Cymbidium mosaic virus）等多种病原生物，均有潜伏期长、发病率高等特点。入境大花蕙兰种苗携带植物病原细菌、病毒等有害生物隐蔽性强、风险较高。
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  苎麻叶斑病病原菌鉴定

  杨 苗， 石延霞， 杜公福， 高 苇， 谢学文， 郭英兰， 李宝聚

  植物病理学报. 2014, 44(3): 318-322.

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  苎麻\[Boehmeria nivea（L.）Gaud\]属荨麻科（Urticaceae）苎麻属（Boehmeria），多年生宿根性草本植物。我国苎麻栽培历史悠久，病害及病原种类多。2010年，在重庆璧山丁家镇高古村苎麻种植区发现一种新病害，该病菌主要为害苎麻叶片，病害蔓延迅速且危害严重，严重时病叶率达50%以上，给当地苎麻产业造成严重损失。为了明确该病害的病原菌种类，本文通过形态学鉴定和致病性测定，结合分子生物学技术对病原菌进行系统鉴定，确定该叶斑病的病原菌为多主棒孢（Corynespora cassiicola）。
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  海南甘蔗病毒病的调查及其病原分子鉴定

  王洪星， 张雨良， 余乃通， 罗志文， 王建华， 杨文君， 刘志昕

  植物病理学报. 2014, 44(3): 323-326.

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  海南是我国重要的甘蔗生产省份之一，但其甘蔗主要种植区感染病毒的种类和数量尚不十分清楚，且海南甘蔗花叶病病原病毒缺乏分子水平的系统鉴定。为明确海南甘蔗病毒病的种类、数量、分布及危害情况，本研究拟建立较为完整的甘蔗病毒病检测技术体系，对海南甘蔗病毒病展开调查，为甘蔗抗病毒基因工程及健康种苗发展提供参考。
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  葡萄A病毒外壳蛋白原核表达及抗血清制备

  任 芳， 董雅凤， 张尊平， 范旭东， 胡国君，朱红娟

  植物病理学报. 2014, 44(3): 327-331.

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  葡萄A病毒（Grapevine virus A，GVA）为线性病毒科（Flexiviridae）葡萄病毒属（Vitivirus）的代表种，是葡萄皱木复合病（rugose wood complex disease）的重要病原之一，可引起葡萄嫁接成活率下降、春季萌芽延迟、生长减弱甚至衰退死亡等危害\[1，2\]。GVA为线状单链RNA病毒，基因组共编码5个开放阅读框（ORF1\|5），其中ORF4 编码外壳蛋白（coat protein， CP），是病毒粒子包裹和系统移动所必需的功能蛋白\[3，4\]。GVA自然寄主为葡萄，机械摩擦可侵染本氏烟等草本寄主\[2\]，由于嫁接和无性繁殖材料调运等因素造成该病毒远距离传播，目前在世界多个国家和地区均有发生。
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  云南芒果变叶病植原体的分子鉴定

  尹跃艳，汪开化，徐忠志，卢训，方琦，丁铭

  植物病理学报. 2014, 44(3): 332-336.

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  植原体（phytoplasma）是一类没有细胞壁，不能离体培养的原核生物，对四环素敏感，主要存在于植物筛管细胞中。植原体主要通过叶蝉、飞虱等取食植物韧皮部的昆虫传播，也可通过菟丝子寄生和嫁接等方式传播。目前，全世界已发现1 000多种由植原体引起的植物病害，我国大陆已报道100余种与之相关的病害\[1\]。由植原体引起的病害症状主要表现为植株花器病态、小叶、丛枝、黄化等，从而导致植物产量和品质明显下降。