2016年, 第46卷, 第1期　刊出日期：2016-01-10

  

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病原学
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  利用常规PCR和实时荧光定量PCR检测杨梅凋萎病菌

  任海英,戚行江,梁森苗,郑锡良

  植物病理学报. 2016, 46(1): 1-10. https://doi.org/10.13926/j.cnki.apps.2016.01.001

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  凋萎病是近年来危害杨梅的主要病害。为了快速灵敏的检测杨梅凋萎病菌(Pestalotiopsis versicolor和P. microspora),本研究开发了常规PCR和SYBR Green实时荧光定量PCR技术各一套。利用P. versicolor (JN861773)和 P. microspora(JN861776)的ITS1-5.8S rDNA-ITS2序列的相同部分设计引物对(Pvm1L/Pvm1R)。该引物对利用常规PCR技术能特异性扩增出杨梅凋萎病菌188 bp的目标产物,而对照菌株则呈阴性。该常规PCR体系能够检测人工接种后21 d和田间自然发病的有病症杨梅组织中的凋萎病菌,检测下限是0.6×10⁵拷贝数。利用Pvm1L/Pvm1R进行SYBR Green实时荧光定量PCR,检测灵敏度是常规PCR的100倍,检测下限是0.6×10³拷贝数,能够检测出人工接种及田间已经感染但尚未表现症状的杨梅组织中的凋萎病菌。这两项技术,简单、快速、灵敏,特异性强,可以应用于杨梅凋萎病的诊断和苗木检疫。
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  来源于猕猴桃的柑橘叶斑驳病毒的RT-PCR检测及外壳蛋白基因序列分析

  朱晨熹,王国平,郑亚洲,杨作坤,王利平,徐文兴,洪霓

  植物病理学报. 2016, 46(1): 11-16. https://doi.org/10.13926/j.cnki.apps.2016.01.002

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  柑橘叶斑驳病毒(Citrus leaf blotch virus,CLBV)为柑橘病毒属(Citrivirus)代表种。本研究采用RT-PCR技术从我国栽培猕猴桃上首次检测到CLBV,总检出率为13.3%。测定了5个CLBV分离物的外壳蛋白基因(coat protein gene,cp)序列,全长均为1 092 核苷酸(nt),分离物间cp基因核苷酸和编码氨基酸序列相似性分别为83.2%~99.7%和91.9%~98.9%,这些分离物与新西兰报道的CLBV猕猴桃分离物M3-A核苷酸序列相似性仅为83%左右,与来源于柑橘及近缘种的CLBV分离物cp基因核苷酸序列相似性为84%~86%。在基于该病毒cp基因核苷酸序列的系统进化树中,本研究所测定的CLBV猕猴桃分离物与新西兰报道的除M3-A外的猕猴桃分离物聚在同一组群。研究结果为进一步明确CLBV在我国猕猴桃上的侵染和危害特点及建立该病毒的分子检测技术提供了重要信息。
细胞生物学、生理学、生物化学、分子生物学
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  GTP酶激活蛋白MoGcs1参与调控稻瘟病菌的无性繁殖,附着胞分化及对外界胁迫的应答

  刘秀,张海峰,张正光,郑小波

  植物病理学报. 2016, 46(1): 17-26. https://doi.org/10.13926/j.cnki.apps.2016.01.003

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  稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)引起的稻瘟病是水稻上的一种毁灭性真菌病害,每年导致的稻谷产量损失可养活6千万人口。从分子水平了解该病菌的致病机理,对新型药剂靶标的挖掘和病害防控策略的制定具有重要的理论和实践指导意义。生物体存在两类GTP结合蛋白,一类是异三聚体G蛋白,另一类是小G蛋白。小G蛋白分子量为20~30 KD,具有GTP酶活性,在多种细胞反应中具有分子开关作用。小G蛋白结合GTP时被激活,可作用于下游分子使之活化。当GTP水解成为GDP时,则恢复为非活化状态。细胞中存在一些专门控制小G蛋白活性的调节因子,如鸟嘌呤核苷酸交换因子(guanine nucleotide exchange factor,GEF)和GTP酶激活蛋白(GTPase activating protein, GAP)。GEF能够催化GTP的转换,而GAP的作用是加速GTP的水解,使小G蛋白向失活的状态转变。本研究在稻瘟病菌中鉴定到一个GAP蛋白MoGcs1,并对该蛋白编码基因的生物学功能进行了研究。对MoGCS1基因进行敲除突变发现,ΔMogcs1突变体产孢量显著下降,分生孢子形态异常,且附着胞形成加快,但突变体的营养生长和致病能力与野生型比较无明显变化。进一步研究发现,突变体对外界盐胁迫敏感性升高,对细胞壁胁迫敏感性降低。上述结果表明,MoGcs1是稻瘟病菌生长发育过程中一个重要的蛋白,参与调控病菌的无性繁殖、附着胞分化及对外界胁迫的应答。
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  十字花科黑腐病菌应急反应相关基因spoT_Xcc对T3SS基因调控作用的分析

  刘国芳,苏辉昭,刘伟,牛祥娜,玉延华,姜伟,何勇强

  植物病理学报. 2016, 46(1): 27-36. https://doi.org/10.13926/j.cnki.apps.2016.01.004

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  通过反向遗传学方法和半定量RT-PCR方法,研究了十字花科黑腐病菌中被注释的应急反应相关基因spoT_Xcc与III型分泌系统(T3SS)基因的调控关系。基于自杀质粒pK18mob 同源整合方法构建了十字花科黑腐病菌spoT_Xcc基因(XC_0956)的非极性整合突变体,检测了突变体的多种表型,发现spoT_Xcc突变体延迟了在非寄主植物辣椒ECW-10R上引发的过敏反应(HR)。利用GUS(β-葡糖苷酸酶)活性检测、原位组织染色和半定量RT-PCR的方法,发现T3SS相关基因在spoT_Xcc基因的非极性整合突变体中表达量降低,表明十字花科黑腐病菌中被注释的应急反应相关基因spoT_Xcc显著正调控T3SS相关基因的表达。
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  7种检疫性植物病原黄单胞菌III型分泌系统和效应蛋白编码基因的差异性分析

  刘良,马文秀,邹丽芳,陈晓斌,陈功友

  植物病理学报. 2016, 46(1): 37-46. https://doi.org/10.13926/j.cnki.apps.2016.01.005

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  γ-变形菌纲(γ-Proteobacteria)的黄单胞菌属(Xanthomonas)的大多数种类可引起植物病害,多数是我国检疫对象。与其他革兰氏阴性植物病原细菌一样,植物病原黄单胞菌可通过高度保守的III型分泌系统(type-III secretion system, T3SS)分泌效应蛋白(T3SS-secreted effectors, T3SEs)进入植物细胞,在非寄主植物和抗病寄主植物上产生过敏反应(hypersensitive response, HR)以及在感病寄主植物上具有致病性。尚不清楚哪些种类的黄单胞菌具有T3SS和缺少哪些T3SE是否可作为检疫的依据。搜集7种检疫性植物病原黄单胞菌,通过PCR和Southern杂交试验结果发现:香蕉细菌性青枯病菌(X. campestris pv. musacearum)的ICMP287和ATCC49084菌株、甘蔗流胶病菌(X. axonopodis pv. vasculorum)ATCC13901菌株、洋葱细菌性叶枯病菌(X. axonopodis pv. allii)的LMG576和LMG578菌株中不含有tale基因,并且ATCC13901菌株既不含有T3SS基因也不含有hpa1和xopQ基因;菜豆细菌性疫病菌(X. campestris pv. phaseoli)ATCC49119菌株不含有hpa1基因。相应地,推测含有2~12个tale基因的黄单胞菌有:大豆斑疹病菌(X. axonopodis pv. glycines)ICMP5732和ATCC43911菌株、豌豆细菌性疫病菌(X. axonopodis pv. vignicola)ATCC11648菌株、棉花细菌性角斑病菌(X. campestris pv. malvacearum)ATCC12131和(X. campestris pv. phaseoli)ATCC49119菌株。大豆细菌性斑疹病菌ATCC43911菌株尽管含有hpa1、xopQ和hrcC基因,但在非寄主烟草上不能激发HR反应;而甘蔗流胶病菌ATCC13901菌株不含有hpa1、xopQ和hrcC基因,却激发烟草产生HR反应。这些结果对于分析比较不同植物病原黄单胞菌的致病性因子和设计特定的植物检疫靶点提供了科学线索。
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  茄青枯拉尔氏菌Rs-T02在3,4,5-三羟基苯甲酸甲酯作用下的差异蛋白分析

  范腕腕,余功明,袁高庆,林纬,魏昌英,黎起秦

  植物病理学报. 2016, 46(1): 47-55. https://doi.org/10.13926/j.cnki.apps.2016.01.006

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  为探明3,4,5-三羟基苯甲酸甲酯(MG)抑制茄青枯拉尔氏菌的机制,利用二维电泳技术,分析了MG作用下茄青枯拉尔氏菌Rs-T02菌株的差异蛋白。结果发现,在MG作用下的菌体中检测出29个差异蛋白点。采用质谱技术鉴定出22个差异蛋白,其中新增蛋白11种、缺失蛋白5种、表达上调蛋白1种和表达下降蛋白5种。这些蛋白参与能量代谢、信号转导、物质运输和DNA修复等途径。我们推测,与能量代谢相关的新增蛋白spot 9和缺失蛋白spot 65可能与MG抑制茄青枯拉尔氏菌的机制有关。
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  黄瓜中与黄瓜绿斑驳花叶病毒侵染相关的miRNA表达特征分析

  梁超琼,刘华威,罗来鑫,李健强

  植物病理学报. 2016, 46(1): 56-62. https://doi.org/10.13926/j.cnki.apps.2016.01.007

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  MicroRNA作为一种内源小分子非编码RNA,在植物生长发育、信号转导、转录调控、新陈代谢及各种胁迫条件下发挥重要作用。本研究通过生物信息学技术对黄瓜miR159和miR858的靶基因进行预测和功能分析,结果显示miR159和miR858的靶基因主要为MYB类转录因子家族成员,参与植物生长发育和抗病过程。实时荧光定量PCR分析黄瓜绿斑驳花叶病毒(CGMMV)不同侵染时期在黄瓜不同组织中目的miRNA的表达特征,结果表明黄瓜miR159和miR858的表达具有时空特异性和组织特异性,二者均可对CGMMV侵染做出响应并存在显著差异表达。
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  烟草丛顶病毒ORF1蛋白的多克隆抗体制备及应用

  王国鲁,王德亚,于成明,原雪峰

  植物病理学报. 2016, 46(1): 63-71. https://doi.org/10.13926/j.cnki.apps.2016.01.008

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  PCR扩增烟草丛顶病毒(Tobacco bushy top virus,TBTV)的ORF1序列并克隆到原核表达载体pEHISTEV中,转化大肠杆菌Rosetta菌株经IPTG诱导表达TBTV ORF1蛋白。利用切胶纯化的ORF1蛋白免疫新西兰大耳白兔制备并获得抗血清,间接ELISA检测效价为1∶24 3000。经抗原亲和纯化从抗血清中得到特异性和灵敏度俱佳的ORF1多克隆抗体。 Western blot分析显示,TBTV ORF1多克隆抗体既可以检测田间发病的烟草丛顶病样品中ORF1 蛋白,也可检测在体内和体外翻译体系中的TBTV ORF1蛋白的表达。另外,发现ORF2 蛋白以ORF1延长蛋白的形式存在,根据ORF1和 ORF2的重叠情况及潜在的七核苷酸滑动序列和下游的稳定二级结构,推测此ORF1延长蛋白是移码翻译产物。
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  寄生于南方根结线虫卵的长梗木霉几丁质酶基因 TlChi46的克隆

  朱先婷,赵洋,王凯,王凤龙,陈德鑫,梁文星,武侠

  植物病理学报. 2016, 46(1): 72-83. https://doi.org/10.13926/j.cnki.apps.2016.01.009

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  为进一步筛选高效寄生线虫真菌和阐明其寄生线虫卵的机理,本研究从湖北省烟草南方根结线虫雌虫分离到1株具高效生防潜力的菌株HBF1。形态学、rDNA-ITS和翻译延长因子tef1-α序列分析鉴定该菌为长梗木霉菌Trichoderma longibrachiatum,其对南方根结线虫卵第10 d寄生率为80.45%。通过简并引物设计和RACE技术克隆其几丁质酶基因,分析该基因序列及与其他几丁质酶的同源性。该菌是1株可以产生几丁质酶的南方根结线虫卵寄生真菌,第10 d几丁质酶的活性达到高峰,为24.88 μmol/h/mL。本研究首次从长梗木霉HBF1菌株中克隆到1个几丁质酶基因TlChi46,该基因DNA全长1 793 bp,含3个内含子和1个1 272 bp的开放阅读框,编码423个氨基酸,理论分子量45.9 kDa,等电点5.23。同源性比对表明和昆虫寄生菌几丁质酶的亲缘关系较远。从长梗木霉HBF1中克隆得到的几丁质酶基因编码的几丁质酶的功能域可供进一步研究,高效产几丁质酶并有效寄生南方根结线虫卵的长梗木霉对南方根结线虫具有良好的生防潜力。
致病性与抗病性遗传
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  四倍体马铃薯SSR遗传图谱的构建及晚疫病抗性QTL初步定位

  刘龙超,周云,贺苗苗,张艳萍,叶广继,王舰

  植物病理学报. 2016, 46(1): 84-90. https://doi.org/10.13926/j.cnki.apps.2016.01.010

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  利用四倍体马铃薯栽培种‘大西洋’和‘陇薯6号’杂交得到的190个F₁株系为作图群体,构建了四倍体马铃薯的分子遗传图谱,采用区间作图法对马铃薯晚疫病抗性进行了QTL初步定位。结果显示:通过对190个F₁株系进行检测,共发现有7个与晚疫病抗性相关的QTL位点,分别分布在第5、6、7、10和11连锁群上;各位点的LOD值在2.70～10.32之间,其中主效QTL位点3个(LOD≥3.5),可解释17.37%～65.68%的表型变异。获得紧密连锁的特异标记(S183-210、S148-460)为进一步进行QTL精确定位提供了参考。
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  基于毒性相关基因序列的稻瘟病菌群体遗传多样性分析

  邓其明,颜学海,何建美,邓元宝,韩冬,杨阳,李彬,朱军,李平

  植物病理学报. 2016, 46(1): 91-102. https://doi.org/10.13926/j.cnki.apps.2016.01.011

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  选用16对毒性相关基因特异性引物对四川和重庆9个县(市)分离到的200个稻瘟病菌单孢菌株进行PCR扩增,并采用最长距离法进行聚类分析,结果显示各引物均能扩增出其目的条带,多态位点百分率(P)高达93.75%,扩增频率差异较大;200个菌株可归为70个不同的单元型,其中单元型SCH13为优势单元型;在0.86遗传相似水平上,200个菌株可划分为27个遗传宗谱,包括1个优势宗谱,3个亚优势宗谱,14个次要宗谱,9个小宗谱,层次丰富;在群体平均水平上,病菌群体具有丰富的遗传多样性(H=0.324 4,I=0.484 2),且群体间差异较大;9个种群在遗传距离为0.05水平上可分为4个类群,种群遗传谱系与地理区域分布呈一定相关性。同时,该地区的群体存在一定的遗传分化(HT=0.320 0),群体内多样性大于群体间多样性(Hs=0.179 6,Dst=0.140 4),总遗传变异的56.13%存在于群体内(Gst=0.438 7),群体间基因流动性较小(Nm=0.639 6)。本研究揭示了四川和重庆部分区域稻瘟病菌群体遗传结构、遗传多样性及其与地理分布之间的关系,为抗病育种和品种布局奠定了基础。
流行学与生态学
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  林芝地区小麦条锈菌转主寄主小檗的鉴定与分布

  赵杰,赵世垒,彭岳林,覃剑锋,黄丽丽,康振生

  植物病理学报. 2016, 46(1): 103-111. https://doi.org/10.13926/j.cnki.apps.2016.01.012

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  西藏自治区是我国小麦条锈病发生与流行相对独立的一个区系,小麦条锈病是严重影响西藏小麦安全生产的重要病害之一,林芝地区是西藏自治区小麦条锈病重要的常发区和流行区。已有研究证实,小檗是小麦条锈菌的转主寄主之一,并在我国小麦条锈菌致病性变异产生新菌系和小麦条锈病的发生过程中起作用。林芝地区小檗种类较多,但目前对林芝地区小檗是否能作为小麦条锈菌的转主寄主缺乏相关的研究和报道。本文针对小麦条锈病常发区的西藏林芝地区小檗资源进行了调查,对小檗能否作为小麦条锈菌转主寄主进行了鉴定。结果表明6种小檗在林芝地区常见且分布广泛,均是小麦条锈菌的转主寄主。这对进一步研究西藏小麦条锈病的发生、流行与病原菌致变性变异起着重要作用。
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  田间空气中小麦白粉菌分生孢子的动态监测研究

  刘伟,姚冬明,范洁茹,曹学仁,陈莉,丁克坚,周益林,邹亚飞,段霞瑜

  植物病理学报. 2016, 46(1): 112-118. https://doi.org/10.13926/j.cnki.apps.2016.01.013

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  2012和2013两年度采用Burkard定容式孢子捕捉器,对田间空气中小麦白粉病菌分生孢子的监测结果表明,小麦冠层内、外白粉菌分生孢子浓度存在显著的正相关性,冠层内的白粉菌分生孢子浓度明显高于冠层外;田间空气中分生孢子的浓度逐渐升高,到小麦灌浆期达到最大值,之后逐渐降低。时间序列分析结果表明,两年度田间空气中白粉菌分生孢子浓度均符合ARIMA(1,1,0)模型,且与温度有显著的相关性,建立了基于温度的白粉菌分生孢子浓度预测模型,模型回归效果均达到了显著水平。研究结果发现,田间白粉病病情与空气中病菌分生孢子和关键气象因子具有显著相关性,并在此基础上分别建立了基于空气中分生孢子浓度,以及基于分生孢子浓度和气象因子的田间白粉病病情预测模型,其中基于分生孢子浓度的预测模型普适性要优于基于分生孢子浓度和气象因子的预测模型,可以用来预测田间小麦白粉病的发生流行程度。
植物病害及其防治
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  一种新的香蕉黑斑病病原菌鉴定及生物学特性研究

  孙嘉曼,张进忠,韦弟,蓝霞,郭文锋,卢江

  植物病理学报. 2016, 46(1): 119-123. https://doi.org/10.13926/j.cnki.apps.2016.01.014

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  在广西香蕉种植区发现一种引起香蕉黑斑病的新病原。通过对病原菌分离培养、致病性测定、形态学观察、分子生物学鉴定及对该病原菌生物学特性进行初步研究，表明引起该病害的病原菌为芒果球座菌(Guignardia mangiferae A.J. Roy)。该病原菌菌落为深橄榄色，产生棒状子囊、梭形子囊孢子及倒梨形分生孢子；其最适生长温度为28℃，最适pH 值为6；病原菌生长较好的碳源为果糖和阿拉伯糖，氮源为蛋白胨和酵母膏；在全光条件下，病原菌菌丝扩展速度最快；菌丝的致死温度为54℃。由G. mangiferae引起的香蕉黑斑病，在国内外为首次报道。
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  草莓灰霉病菌对嘧菌酯的抗性检测及抗性菌株的生物学特性研究

  张佳,张璨,芦帆,蔡乐,张国珍

  植物病理学报. 2016, 46(1): 124-130. https://doi.org/10.13926/j.cnki.apps.2016.01.015

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  由灰葡萄孢(Botrytis cinerea Pers.)引起的草莓灰霉病是严重危害草莓的病害之一。为了解草莓灰霉病菌对杀菌剂嘧菌酯的抗性情况,本研究针对2012年从国内10省市采集和分离的134株草莓灰霉病菌菌株,利用特异性引物BcAR-F/BcAR-R扩增其cytb基因的部分序列,进行了嘧菌酯抗性的分子检测;对检测出的抗性菌株在嘧菌酯浓度分别为22.4、112和224 μg·mL^-1的含药培养基上进行抗性验证;此外,还比较了抗性菌株与敏感菌株主要生物学性状的差异。结果表明,有54个菌株对嘧菌酯表现抗性,均属于中等抗性水平,占检测总数的40.3%,分布于北京市、湖北、江苏、河北、辽宁和四川各省;对15个抗性菌株cytb基因的序列分析表明,其第143位发生突变,由甘氨酸变为丙氨酸;对随机选取的4株抗性菌株和2株敏感菌株的适合度测定结果发现,抗性菌株和敏感菌株在最适生长温度、菌落生长速度、孢子萌发率方面没有表现出规律性差异,但抗性菌株的产孢量和致病力均显著低于敏感菌株。
研究简报
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  红树植物—白骨壤黑斑病病原菌的分离与鉴定

  苏会荣,何红,林巧玲,凌东海,朱拥军

  植物病理学报. 2016, 46(1): 131-134. https://doi.org/10.13926/j.cnki.apps.2016.01.016

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  降香黄檀黑痣病菌的快速分子检测

  刘倩丽,周国英,李河,董文统,刘成锋,刘君昂

  植物病理学报. 2016, 46(1): 135-139. https://doi.org/10.13926/j.cnki.apps.2016.01.017

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  茎枯病菌毒素制备及对芦笋愈伤组织抗性诱导的研究

  李俊萍,乜兰春,王珊珊,刘孟

  植物病理学报. 2016, 46(1): 140-144. https://doi.org/10.13926/j.cnki.apps.2016.01.018

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