利用RT-PCR从江苏玉米上克隆水稻黑条矮缩病毒(RBSDV)的全基因组,其基因组10个片段核苷酸数目和蛋白编码情况与已报道的RBSDV分离物基本一致。 基因组的序列一致性分析和系统进化树表明,RBSDV基因组片段间存在频繁的RNA重排现象;江苏玉米分离物(JS)与湖北玉米分离物(HuB)和河北小麦分离物(HeB)的整体亲缘关系较近,而与安徽分离物(AH-MX8)的整体亲缘关系最远。综合本研究及前人对S8 和S10的研究,RBSDV基因组不同片段的进化中RNA重组的作用不同: S1、S2和S4中没有RNA重组;S3、S5、S6、S8和S10中存在低频率重组;S7 和S9存在较高频率重组,其中S7的高频率重组尤为显著。
在实验室中利用灰飞虱接种小麦时出现一种新的病毒病症状，鉴定表明其病原为大麦黄条点花叶病毒(Barley yellow striate mosaic virus, BYSMV)。采用生物学测定、电镜观察、RT-PCR检测和序列分析的方法，明确了该病毒的粒体特性、危害症状及田间发生情况。接种试验表明该病毒通过灰飞虱传播，接种7~10 d后小麦新生叶片出现黄色斑点、斑驳，继而发展成黄色条纹，叶片对生且细而窄，重病株新叶扭曲，叶鞘不能伸长，病株矮化。对小麦病叶超薄切片电镜观察，发现细胞质中存在大量弹状病毒粒子，病毒粒体大小为（315~353）nm×（46~57） nm。利用特异性引物从病株总RNA中扩增出 565 bp基因片段，序列同源性分析显示与大麦黄条点花叶病毒(Barley yellow striate mosaic virus, BYSMV) Zanjan-1分离物聚合酶（L）基因对应序列的一致性为97 %，与北方禾谷花叶病毒(Northern cereal mosaic virus, NCMV) L基因对应序列的一致性为78 %~79 %。对采自河北邯郸、石家庄、保定、唐山的31株样品进行RT-PCR检测，25株检测到BYSMV，7株检测到水稻黑条矮缩病毒(Rice black streaked dwarf virus，RBSDV)，其中5株为2种病毒复合侵染，结果表明BYSMV的田间分布较广。系统发育分析表明BYSMV-Lab/TS/ZX/QY 4个分离物与本研究的BYSMV亲缘关系密切。BYSMV是我国小麦上新发现的一种弹状病毒，并已形成危害，暂定名为小麦黄条纹矮缩病，应加强流行动态监测。
应用DAS-ELISA和RT-PCR方法从褪绿和银色斑驳的西瓜叶片中检测到病毒分离物（WSMoV-YN），感病样品能与WSMoV/GBNV复合抗血清（Agdia）呈阳性反应。获得WSMoV N蛋白的多克隆抗体，抗体能与WSMoV血清组成员CaCV和TZSV反应，但不能与INSV、TSWV、HCRV和GYSV反应。为明确引起该病害的病毒种类，采用Tospovirus通用引物对样品的总RNA进行RT-PCR扩增，获得长度为3 554 nt的S RNA全序列，经Blastn比对分析与WSMoV中国台湾分离物同源性最高，为95.8%，其N和NSs蛋白氨基酸序列同源性分别为99%和97.6%。构建系统进化树发现，西瓜银灰斑驳病毒云南分离物（WSMoV-YN）与其他WSMoV聚为一支。确定引起云南西瓜病害的病毒为WSMoV。
潜根线虫(Hirschmanniella spp.)是一类寄生于水稻根部的重要病原线虫,在我国多个省份和地区皆有分布,然而江苏稻区有关该线虫发生和危害鲜有报道。从江苏省农科院水稻实验田采集的水稻根部分离到大量潜根线虫,利用光学和扫描电镜显微观察确定所分离到的线虫优势种群为细尖潜根线虫(Hirschmanniella mucronata),de-Man形态学数据显示江苏分离群体与其他已报道的H. mucronata分离群体具有一定差异,但基本处于标准模式值范围。分别对ITS-rRNA、28S rRNA D2-D3扩展区、18S rRNA、细胞色素氧化酶c亚基I(COI)和热激蛋白90(Hsp90)序列进行PCR扩增,新获得的H. mucronata ITS序列与中国台湾和比利时分离群体具有高度相似性,同时比较各分离群体的ITS1、5.8S和ITS2序列碱基变异,显示我国江苏、台湾和比利时群体差异最小。基于28S rRNA D2-D3扩展区、18S rRNA和ITS-rRNA序列构建的贝叶斯和最大似然进化树将潜根线虫划分为3个进化分支,与已报道的其他H. mucronata种群共同位于第二分支。
小麦条锈病是我国小麦生产上的重要病害之一。为高效准确地定量检测处于潜伏侵染阶段的小麦条锈菌,本研究根据已发表的小麦条锈菌和寄主小麦的引物,设计了各自的探针,建立了双重real-time PCR检测方法。为排除多个引物互作造成的干扰,对小麦条锈菌引物探针体系、小麦体系以及二者的双重real-time PCR体系进行了比较。CT值相关线性回归分析证明,引物之间互作很小,对定量检测无影响。已知浓度样品经梯度稀释,进行灵敏度检测,确定了双重real-time PCR对小麦条锈菌DNA和小麦DNA准确定量测定的最小检测限为0.4 pg和0.5 ng。同时建立了小麦条锈菌和小麦各自的标准曲线。用此方法检测来自两个不同地区的田间样本,得到的分子病情指数(MDI)与随后的发病趋势一致。本研究建立的双重real-time PCR分析方法可靠、高效、低误差,是对本实验室已有小麦条锈菌潜伏期分子检测方法的进一步优化。
本研究测试了八个水稻白叶枯病抗性基因Xa3、Xa4、xa5、Xa7、Xa10、Xa11、Xa14和Xa23在相应载体品种上对华南白叶枯病优势致病菌系Ⅳ型菌和强毒菌系Ⅴ型菌的抗性反应;分析了Xa4、xa5、Xa7和Xa23抗病基因与不同感病品种杂交组合F1的抗性表达模式以及显性抗病基因Xa7和Xa23在杂交水稻上的利用价值。结果表明:大部分抗性基因在不同载体品种上抗性表达一致,但也有少数基因在不同载体品种上抗性表现不一,甚至截然相反,说明不同遗传背景对抗性表达有影响,而这种影响因不同抗性基因而异。隐性抗病基因xa5(IRBB5)和显性抗病基因Xa23(CBB23)与感病亲本组合的F1代分别表现感病和抗病,符合隐性基因或显性基因的抗性表达模式;而2个显性抗病基因Xa4(IRBB4))和Xa7(IRBB7)与感病亲本组合的F1代,有部分组合的F1代表现抗病,符合显性基因的抗性表达模式,有部分组合的F1代表现感病,不符合显性基因的抗性表达模式。在杂交水稻上的利用价值方面,Xa7与2个不育系组合的F1代均表现高感,不宜在杂交水稻上利用;Xa23(CBB23)与4个感病亲本,无论是不育系还是常规稻组合的4个F1代全部表现抗病,抗性在F1充分表达,在杂交水稻上有重要的利用价值。
水稻丽江新团黑谷(LTH)是一个云南地方粳稻普感品种,对全球近2 800多个稻瘟病菌生理小种均表现为感病表型。本研究为利用60Co-γ射线辐照处理LTH种子,分单株收获M1代种子。对M2和M3代植株分别进行稻瘟病的自然诱发筛选和人工喷雾接种筛选,以期从LTH中筛选获得抗性提高的突变体。在突变体筛选过程中,我们发现突变体的遗传背景受到零星异交或混杂干扰,这种情况在其他本底抗性水平较高的抗性突变体筛选中往往容易被忽略。为了确保突变体遗传背景的真实性,我们利用分布在水稻12条染色体上的在粳稻LTH与籼稻品种间存在多态性的In/Del标记,分析候选抗性植株是否为LTH纯合背景,以排除杂合假抗性个体。通过两种不同的筛选策略,最终从M3代植株中分别鉴定出1份和4份抗性突变体,为进一步研究LTH普感特性奠定基础。将其中一个LTH抗病突变体分别与野生型LTH和籼稻普感品种CO39进行杂交,获得的F2群体人工喷雾接种稻瘟病菌后调查抗、感植株的分离情况,分析结果显示,该突变体性状符合单个显性基因控制的遗传规律。另外,本研究结果表明:在水稻诱变育种工作中,不仅要做到充分隔离,还需借用分子标记辅助剔除零星意外串粉造成的杂合假突变体,以提高水稻突变体筛选的准确率。
通过2012—2014年田间小区试验,对沈阳地区葡萄霜霉病自然发病情况进行了系统调查和对比分析,并对影响葡萄霜霉病流行动态的气象因素进行了相关性分析。结果表明,沈阳地区葡萄霜霉病的季节流行曲线是典型的单峰S形曲线。应用SPSS19.0软件分析,明确了Logistic模型能够反映沈阳地区葡萄霜霉病流行时间动态情况。同时,推导了病害流行阶段:指数增长期为7月上旬至7月下旬,该时期为最佳药剂防治时期;逻辑斯蒂增长期为7月下旬至8月下旬;衰退期为8月下旬至葡萄生育末期。不同生长季病害发生日期、流行阶段天数和最大病情指数虽各不相同,但与Logistic模型推导趋势基本一致。各个流行阶段病害的表观侵染速率表现为:始发期＞盛发期＞衰退期。始发期和盛发期的是决定整个生长季葡萄霜霉病流行程度的关键时期。气象因素对葡萄霜霉病的流行有明显影响,其中表观侵染速率与7 d平均相对湿度、7 d累计降雨量和7 d叶面湿润时数成显著正相关,而与7 d平均气温呈显著负相关,以上4个气象因素是影响沈阳地区葡萄霜霉病流行的主导因子。
为明确一种新的香蕉（Musa sapientum）细菌性叶斑病病原菌，以云南省新平县香蕉园区发现的一种新病害为供试材料，通过分离培养、形态观察、致病性测定、生理生化试验和gyrB，16S rDNA 和 rpoB基因片段分析，对病原菌进行了鉴定。该病由克雷伯氏肺炎球菌肺炎亚种（Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae）引起，病菌可侵染香蕉叶片、假茎和果实。茎干被病原菌侵入3 d后即可出现黑色小斑点，在接种部位附近呈上下方向蔓延趋势，7 d后茎干上出现大面积棕色坏死，内部组织褐变。本文在世界上首次报道克雷伯氏肺炎球菌肺炎亚种可侵染香蕉植株，引起香蕉细菌性叶斑病。
为了探明桉树内生细菌群落变化与桉树对青枯病抗性间的关系,试验用加入抗生素的培养基继代培养尾叶桉组培苗,采用PCR-DGGE技术检测了经抗生素处理后桉苗内生细菌的变化,并测定其对青枯病的抗性。结果显示,浓度为60 mg·L-1的氯霉素和150 mg·L-1的氨苄青霉素显著降低了桉树组培苗根部内生细菌的数量,但对茎、叶中内生细菌的数量没有影响。DGGE图谱显示,氨苄青霉素处理的桉苗与对照苗的条带基本一致,氯霉素处理后与对照条带有明显的区别,表明氨苄青霉素只影响了桉苗内生细菌的数量,氯霉素使桉苗内生细菌的优势菌发生了变化。对DGGE条带克隆测序和Blast比对发现,A、B、C条带的序列(KU363009、KU363010和KU363011)与GenBank中不可培养细菌的序列(KJ655389.1、KF006350.1和FJ832152.1)相似性分别为100%、99%和99%;D条带序列(KU363012)与不可培养的色球藻属(Chroococcidiopsis sp.)序列(LN878320.1)相似性达到98%。氨苄青霉素和氯霉素处理后,桉苗青枯病的初发病时间与对照相比延后1~2 d,氨苄青霉素处理的桉苗发病率显著低于对照。氯霉素处理的前6 d发病率显著低于对照,之后发病率急剧上升与对照无显著差异。上述结果表明,氨苄青霉素和氯霉素可以减少桉苗根中内生细菌的数量,并推迟桉树青枯病的发病时间。
根结线虫是一种重要植物病原线虫,常用杀线虫剂噻唑膦、阿维菌素等进行防治。研究生防真菌淡紫紫孢菌颗粒剂与低剂量杀线虫剂复配对根结线虫的防治效果,结果显示当浓度低于100 μg·mL-1时,噻唑膦对淡紫紫孢菌的菌落生长和孢子萌发无显著影响;且低剂量噻唑膦与淡紫紫孢菌复配对线虫二龄幼虫的致死率高于单独使用噻唑膦或淡紫紫孢菌的。盆栽及大棚试验都表明阿维菌素减量25%、或噻唑膦减量25%、或噻唑膦减量50%后分别与淡紫紫孢菌颗粒剂复配,对根结线虫的防效与单独使用阿维菌素、噻唑膦或淡紫紫孢菌相当。因此,噻唑膦及阿维菌素与淡紫紫孢菌复配,可减少农药使用量,并弥补生物防治稳定性不强等缺点,是可选的植物线虫病害防治策略之一。
