2017年, 第47卷, 第4期　刊出日期：2017-08-10

  

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病原体
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  进境美国柚子中冬生疫霉的分离鉴定

  焦彬彬, 刘劼, 宋绍祎, 陈仲兵, 于翠, 易建平

  植物病理学报. 2017, 47(4): 433-439. https://doi.org/10.13926/j.cnki.apps.000025

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  从美国加州进境柚子表现褐腐症状的组织中分离到1个疫霉菌株9099,对其进行形态学特征观察、PCR检测、序列分析和致病性测定。试验结果表明,该菌株在V8培养基上菌落平贴,呈花瓣状;在PDA培养基上菌落边缘不规则,白色。孢子囊卵形或椭圆形, 大小为(28.4～46.8) μm×(16.3～23.8) μm(平均37.5 μm×19.4 μm),长宽比为1.7～2.2∶1(平均1.9∶1)。菌株为同宗配合, 卵孢子黄橙色,球形,满器,大小26.3～39.3 μm (平均32.7 μm),壁厚1～3 μm。利用冬生疫霉(Phytophthora hibernalis)特异引物对PHIB1/PHIB2和751F/752R扩增9099的基因组DNA分别得到407 bp和616 bp的预期目标条带。菌株9099的ITS序列与GenBank中P.hibernalis的序列相似性为99.89%～100%。基于ITS序列构建的系统进化树显示菌株9099与P. hibernalis聚在同一个分支,亲缘关系最近。创伤接种柚子果实,接种处组织出现典型褐腐症状。根据形态学特征及ITS序列分析等,将菌株9099鉴定为P. hibernalis。
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  石楠叶斑病病原鉴定及对药物敏感性测定

  于静亚, 董立坤, 王志华, 沈锦, 徐慧, 聂超仁, 段庆明

  植物病理学报. 2017, 47(4): 440-447. https://doi.org/10.13926/j.cnki.apps.000024

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  石楠(Photinia serrulata Lindl.)是华中地区一种重要的绿化树种。近年来在武汉地区石楠上发现一种新的叶斑病。本文通过组织分离法、致病性测定等从病株分离得到致病病原菌, 并通过形态学鉴定、分子生物学鉴定等, 最终确定该致病菌为小孢拟盘多毛孢(Pestalotiopsis microspora)。在室内测定了P. microspora对7种常见杀菌剂的敏感性, 结果表明, 7种杀菌剂对P. microspora的菌丝生长均有抑制作用, 但不同杀菌剂之间EC50值相差较大。450 g·L^-1咪鲜胺水剂、70%甲基托布津可湿性粉剂、10%苯醚甲环唑水分散粒剂EC50值分别为0.099、0.142和0.631 μg·mL^-1。25%三唑酮可湿性粉剂EC50值在7种杀菌剂中最大, 为37.625 μg·mL^-1。这是国内外关于P. microspora引起石楠叶斑病的首次报道。
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  稻瘟菌双分病毒MoPV2特性研究

  陈伟博, 梁克力, 李阳艺, 谢甲涛, 程家森, 付艳苹

  植物病理学报. 2017, 47(4): 448-457. https://doi.org/10.13926/j.cnki.apps.000097

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  稻瘟病是稻瘟菌引起的一种世界性病害,每年造成水稻大幅减产。真菌病毒是指能够在真菌体内进行复制和繁殖的病毒,可以作为生物防治的资源。本实验从发病的水稻叶片上采用单孢分离的方法获得纯化培养的稻瘟菌菌株YC13。菌株YC13携带多条dsRNA片段,其中片段F1与Magnaporthe oryzae virus 2(MoV2)的Coat Protein (CP)和RNA-dependent RNA polymerase (RdRp)的氨基酸序列均具有99%的同源性,确定为MoV2的基因组;片段F4、F5序列与双分病毒Penicillium stoloniferum virus F (PsV-F)的RdRp和CP的氨基酸序列分别具有69%和63%的同源性,命名为Magnaporthe oryzae partitivirus virus 2(MoPV2)。MoPV2的基因组含有2条dsRNA:dsRNA 1编码RdRp,dsRNA 2编码CP。根据MoPV2的RdRp编码的氨基酸序列将MoPV2归属于双分病毒科(Partitiviridae) Gammapartitivirus属,是一种新的真菌病毒。通过病毒粒子转染,将MoPV2转到稻瘟菌菌株RB11。与菌株RB11相比,带毒菌株RB11T25的分生孢子产生量显著减少,并且对大麦活体的致病性也有所降低,但其他生物学特征均无明显的影响。本研究在稻瘟菌中发现了一种新的真菌病毒,该病毒能够使稻瘟菌致病力下降,为稻瘟病的防治提供了潜在的病毒资源。
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  锦葵脉明病毒中国蜀葵分离物cp基因序列分析

  杨锋, 牛二波, 王德富, 牛颜冰

  植物病理学报. 2017, 47(4): 458-462. https://doi.org/10.13926/j.cnki.apps.000094

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  本研究利用双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA)和非序列依赖性PCR扩增技术(sequence-independent amplification,SIA)对表现出条斑症状的感病蜀葵进行了病原鉴定,结果发现侵染蜀葵的病原为锦葵脉明病毒(Malva vein clearing virus,MVCV),这是锦葵脉明病毒在国内首次报道。为进一步明确锦葵脉明病毒中国蜀葵分离物(MVCV-AR)的来源及进化关系,克隆获得其外壳蛋白(coat protein,cp)基因(GenBank登录号为KX619649)。通过与其他MVCV分离物的核苷酸及氨基酸序列比对分析可知,MVCV-AR与 Mexico的tomato分离物(FJ561293)的核苷酸同源性最高为90.5%;与来自Italy的DS-Ba-01分离物(FM212972)的氨基酸同源性最高为98.3%。系统进化分析表明,MVCV-AR与DS-Ba-01分离物聚为一簇,形成独立的分支。

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  甘蔗花叶病毒第IV组分离物RT-PCR检测体系的建立及应用

  闫志勇, 程德杰, 房乐, 许小洁, 田延平, 贾曦, 李向东

  植物病理学报. 2017, 47(4): 463-469. https://doi.org/10.13926/j.cnki.apps.000061

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  甘蔗花叶病毒(Sugarcane mosaic virus,SCMV)是引起我国玉米矮化叶病的主要病毒。根据其基因组序列,SCMV可以分为4个组,其中第IV组分离物属于新出现的强毒株系。为了快速检测SCMV尤其是IV组分离物的发生情况,我们针对SCMV I-IV组及IV组分离物设计了6对引物,从中筛选出特异性最强的2对引物(I-IV-2F/I-IV-2R和IV-1F/IV-1R),进行PCR体系的优化。优化后的PCR体系为:退火温度51℃,dNTP终浓度为0.1 mM,引物终浓度为0.20 μM,TaqDNA聚合酶终浓度为0.015 U·μL^-1。利用该体系, 引物对I-IV-2F/I-IV-2R和IV-1F/IV-1R均能够从50 ng感病叶片或0.05 ng病毒RNA中检测出SCMV。通过优化两对引物浓度比例建立了能同时检测SCMV所有分离物及第四组分离物的双重PCR体系。利用该体系从山东、河南及云南均检测出SCMV第IV组分离物的发生。本研究为SCMV尤其是SCMV第IV组分离物的快速检测提供了技术支持。
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  太子参蚕豆萎蔫病毒2号CP基因的遗传多样性及分子进化分析

  匡云波, 叶炜, 李金辉, 于静静, 叶祖云

  植物病理学报. 2017, 47(4): 470-478. https://doi.org/10.13926/j.cnki.apps.000095

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  为了解太子参蚕豆萎蔫病毒2(Broad bean wilt virus 2,BBWV2)的遗传多样性及分子进化关系,本研究对5个不同地理来源的6份太子参病叶样品进行了BBWV2外壳蛋白(coat protein,CP)基因的RT-PCR扩增和克隆。序列分析结果表明,所得13条太子参BBWV2 CP基因序列均为1 345 bp,其核苷酸序列同一性在81.0%～99.0％之间,氨基酸序列同一性在93.5%～99.3％之间;核苷酸多样性为0.084 00;存在280个核苷酸多态性位点,其中232个为地域特异性位点;总变异数为278个,其中同义突变29个,异义突变249个。不同地理来源的太子参BBWV2分离物之间遗传分化程度较高,基因交流不频繁,遗传漂变可能导致分离物间明显的遗传分化。在系统进化树中,太子参分离物的聚类呈现出明显的地域特异性,江苏、贵州、湖南、福建分离物均聚类在I-a亚组,而山东分离物聚类在II-c亚组,遗传距离较远。研究表明,太子参BBWV2存在很高的遗传变异,基因突变是其产生遗传多样性的主要驱动力,而地理因素与其具有较高的核苷酸多样性密切相关。
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  一种侵染鳢肠的双生病毒基因组特征

  钟静,赵丽玲,尹跃艳, 李婷婷, 丁铭, 李凡

  植物病理学报. 2017, 47(4): 479-486. https://doi.org/10.13926/j.cnki.apps.000099

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  菜豆金色花叶病毒属病毒是热带及亚热带地区经济作物的重要病原病毒,该类病毒在田间的杂草寄主范围较为广泛。本研究从云南红河流域采集到叶脉黄化的鳢肠植株,经克隆获得了菜豆金色花叶病毒属病毒分离物YN3306,该分离物核苷酸序列全长2 749 nt,具有典型的双生病毒基因组结构特征。进一步分析发现,分离物属于金腰剑曲叶病毒(Synedrella leaf curl virus,SyLCV) ,RDP软件分析表明,该分离物是由烟草曲茎病毒(Tobacco curly shoot virus,TbCSV)、云南烟草曲叶病毒(Tobacco leaf curl Yunnan virus,TbLCYnV)和金腰剑曲叶病毒重组产生的病毒。本研究首次报道了GenBank中在印度注册的SyLCV可以侵染鳢肠植株。

细胞生物学、生理学、生物化学、分子生物学
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  禾谷丝核菌基因组SSR标记的开发及评价

  李伟, 张兴, 孙海燕, 邓渊钰, 张爱香, 马东方, 陈怀谷

  植物病理学报. 2017, 47(4): 487-494. https://doi.org/10.13926/j.cnki.apps.000027

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  群体遗传学研究对于了解病原菌的流行、变异及进化规律具有重要意义。但是到目前为止,对小麦纹枯病菌禾谷丝核菌群体遗传结构的了解并不深入,缺乏有效的SSR标记是主要原因。本研究根据禾谷丝核菌全基因组序列进行了微卫星位点搜索并设计SSR引物,通过电泳筛选和测序验证,最终筛选出12个多态性较好且稳定可靠的SSR标记。利用这些标记对收集自我国安徽、江苏、河南三省的23个禾谷丝核菌菌株进行了多态性分析,结果发现禾谷丝核菌基因组中长片段微卫星位点较少。12对引物扩增出的等位基因数平均为6.1个,期望杂合度平均为0.651,观测杂合度平均为0.508,表明这些标记具有较高的多态性,能够满足禾谷丝核菌群体遗传学研究需要。本研究为进一步进行禾谷丝核菌的多样性、群体遗传结构分析及进化学研究提供了有效工具。
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  桑椹菌核病菌(Scleromitrula shiraiana)黑色素生物合成相关基因的克隆与功能分析

  康鑫, 吕志远, 黄艳, 向仲怀, 何宁佳

  植物病理学报. 2017, 47(4): 495-504. https://doi.org/10.13926/j.cnki.apps.000023

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  小柱孢酮脱水酶(scytalone dehydratase, SCD)及羟基萘还原酶(hydroxynaphthalene reductase, HNR)是真菌多聚二羟奈类(DHN)黑色素生物合成途径中的关键酶。根据已知真菌的小柱孢酮脱水酶及羟基萘还原酶的保守结构域设计兼并引物并利用RACE技术,获得桑椹菌核病菌(核地仗菌,Scleromitrula shiraiana)SsSCD1和Ss4HNR1的DNA和cDNA序列。SsSCD1和Ss4HNR1均含2个内含子和3个外显子,分别编码169和263个氨基酸残基。进化分析表明SsSCD1和Ss4HNR1与灰葡萄孢和核盘菌中小柱孢酮脱水酶和四羟基萘还原酶基因的亲缘关系最近。DHN黑色素合成特异性抑制剂三环唑处理核地仗菌,结果显示三环唑可抑制核地仗菌菌丝生长和黑色素合成,对SsSCD1的表达无显著影响,但Ss4HNR1的表达水平显著提高。这些结果表明三环唑能够特异性的抑制四羟基萘还原酶,且DHN黑色素是核地仗菌生长发育的重要产物。
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  本生烟病程相关蛋白PR-10的原核表达及抗血清制备

  张超, 姜宁, 武文琦, 王颖, 李大伟, 于嘉林, 韩成贵

  植物病理学报. 2017, 47(4): 505-510. https://doi.org/10.13926/j.cnki.apps.000111

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  病程相关蛋白 (Pathogenesis-related proteins, PRs) 是植物受生物或非生物胁迫后诱导并积累的一类蛋白质,具有抗病抗逆的多种功能。为检测本生烟病程相关蛋白10 (Nicotiana benthamiana Pathogenesis-related protein 10, NbPR10)的表达,制备其抗血清,并用以探究其可能的特性和功能。将已有的NbPR10基因构建到原核表达载体pGEX-KG中获得重组质粒pGEXKG-NbPR10,转化大肠杆菌BL21(DE3),经0.2 mM IPTG诱导表达分子量约44 kDa的融合蛋白(含GST标签),用GST亲和柱纯化获得纯化的融合蛋白。以纯化的融合蛋白为抗原免疫家兔制备NbPR10蛋白的抗血清,经Western blot测定抗血清效价达1∶10 000,能至多检测到稀释比例为1∶320的转基因本生烟叶片中的PR10蛋白或1 ng原核表达的蛋白,且能检测到本生烟根和茎中的PR10蛋白,证明PR10在本生烟根和茎中表达量较在叶部高,为进一步研究NbPR10蛋白的功能提供参考。
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  水稻miR444b.2调控稻瘟病抗性及分蘖

  肖之源, 王青霞, 王贺, 李金璐, 赵胜利, 樊晶, 李燕, 王文明

  植物病理学报. 2017, 47(4): 511-522. https://doi.org/10.13926/j.cnki.apps.000019

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  microRNA(miRNA)是一类长度在20～24 bp的保守小RNA分子,广泛存在于真核生物中,参与调控生长发育及抗逆、抗病等反应。在前期研究中,我们对比感病和抗病水稻材料在接种稻瘟病菌前后miRNA的累积量,发现miR444b.2的累积量变化在抗病和感病材料间存在显著差异,但其在水稻对稻瘟病抗性中的作用尚不清楚。本文进一步对水稻感病和抗病材料接种稻瘟病菌,通过检测不同时间点miR444b.2及其靶基因的累积量来分析miR444b.2与水稻稻瘟病抗性的关系;同时,构建过表达miR444b.2的转基因水稻材料,对转基因材料进行了抗性分析及农艺性状分析。结果表明,在稻瘟病菌开始侵染水稻的24 h内,随着侵染时间的增加,miR444b.2在感病材料中的累积量也随之增加,而在抗病材料中的累积量则逐渐降低;相反,miR444b.2的靶基因中,MADS盒家族基因在感病材料中的转录受到抑制或变化不大,在抗病材料中的表达明显增加,与miR444b.2的累积量变化趋势相反,提示miR444b.2可能通过调节MADS盒家族基因的表达量来调控稻瘟病抗性。而且,过表达miR444b.2的转基因植株变得更加感病,主要表现为:与对照相比,叶片发病病斑数量增多、病斑面积增大、防御相关基因转录水平变低;而miR444b.2的靶基因在过表达miR444b.2的转基因植株中的转录水平显著降低。此外,miR444b.2过表达植株的分蘖数较对照减少。这些结果说明,miR444b.2通过调控MADS盒家族基因来负调控稻瘟病抗性及调节水稻分蘖。
致病性与抗病性遗传
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  小麦农家种红秃头和霸王鞭的抗白粉病基因分析及染色体定位

  徐晓丹, 范洁茹, 周益林, 马占鸿

  植物病理学报. 2017, 47(4): 523-531. https://doi.org/10.13926/j.cnki.apps.000022

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  本研究对红秃头和霸王鞭两个小麦农家种抗白粉病基因推导显示,红秃头和霸王鞭均具有较宽的抗性谱,是良好的抗源品种,并可能携带新的抗病基因。抗白粉病遗传分析表明,红秃头对E09的抗性由1对显性基因控制,对E26和E30-2的抗性分别由1对隐性基因控制,其至少携带一显一隐2对抗白粉病基因;霸王鞭对E09的抗性由2对显性基因重叠或者独立控制,对E26的抗性由2对显性基因互补作用控制,对E30-2的抗性由1对显性基因控制,其至少携带2对显性基因。利用基因芯片结合集群分离分析法(Bulk Segregant Analysis, BSA)进行染色体定位推测出,红秃头的抗白粉病基因可能位于染色体7B和6B上,霸王鞭的抗白粉病基因可能位于染色体4A和7B上。

植物病害及其防治
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  应用real-time PCR评价三种杀菌剂对小麦条锈病的防治效果

  初炳瑶, 龚凯悦, 谷医林, 王翠翠, 潘阳, 骆勇, 马占鸿

  植物病理学报. 2017, 47(4): 532-540. https://doi.org/10.13926/j.cnki.apps.000059

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  为更加精确有效地评估杀菌剂对小麦条锈病的防效,本研究利用real-time PCR检测潜育阶段的分子病情指数(molecular disease index, MDI)并结合田间病情分析,对三种杀菌剂的防效进行评价。春季返青后在品种铭贤169和京0045试验小区的诱发中心接种小麦条锈菌夏孢子,待充分发病后将其铲除。设置播种前2%立克秀拌种,接种后21和28 d分别喷施25%阿米西达和30%苯甲-丙环唑1 500倍液三种处理。发病后调查不同处理的普遍率和严重度,计算病情指数和AUDPC。结果表明,阿米西达和苯甲-丙环唑对小麦条锈病具有良好的防效且能够明显抑制发病中心的扩展,而经立克秀拌种对该病害的防治效果和发病中心扩展的抑制作用均不理想。对京0045于发病中心接种后24和33 d采样,经双重real-time PCR定量检测,计算MDI。结果显示潜育检测获得的MDI与AUDPC之间均具有极显著的相关性;阿米西达和苯甲-丙环唑对潜育期小麦条锈菌的扩展具有明显的持续抑制作用,而立克秀拌种仅对小麦条锈菌潜伏初期的扩展表现出一定的抑制作用。
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  两株铁皮石斛内生真菌对组培苗和原球茎生长的影响

  喻静, 蒋海侠, 张保钱, 金磊磊, 徐德林, 张本厚, 陈集双

  植物病理学报. 2017, 47(4): 541-550. https://doi.org/10.13926/j.cnki.apps.000062

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  在铁皮石斛内生真菌的研究中,获得了对组培苗的生长呈现不同影响的两株内生真菌DCN-1和DCN-3,为探究其对组培苗和原球茎生长的影响,首先对已分离纯化的菌株DCN-1和菌株DCN-3进行菌株形态和ITS1-5.8S-ITS2区段序列鉴定;采用孢子悬浮液注射和菌丝体附着伤口的方法对铁皮石斛组培苗和原球茎进行接种,观察组培苗的生长情况;参照柯赫氏法则对菌株进行重新分离,并结合切片观察结果验证侵染情况。结果显示:菌株DCN-1和菌株DCN-3分别与Myceliophthora verrucosa 、Gibberella moniliformis 的相似度最高,其中菌株DCN-1对组培阶段和移栽后的组培苗和原球茎的生长无明显影响,菌株DCN-3会导致组培阶段的植株苗枯萎甚至死亡而对移栽后的组培苗影响不大,但抑制原球茎的生长。徒手组织切片观察及二次分离结果分析显示:两株内生真菌均成功侵染植株体内,并确定相应植株的生长状况与该两株内生真菌的侵染相关。两株内生真菌在在营养较丰富的组织培养条件下对铁皮石斛组培苗和原球茎造成不同的影响,为探究其与铁皮石斛的相互作用和促进铁皮石斛植株生长及有效活性物质产生的复合型菌制剂提供了依据。
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  人工饲养不同世代灰飞虱群体传播水稻黑条矮缩病毒的比较

  杨菲, 张爱红, 闫冲, 孟凡思, 霍良占, 邸垫平, 苗洪芹, 王锡锋

  植物病理学报. 2017, 47(4): 551-557. https://doi.org/10.13926/j.cnki.apps.000060

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  为明确人工饲养对灰飞虱传毒能力的影响,本文利用人工饲养至第55代、23代和8代的3个无毒灰飞虱群体,研究灰飞虱携带和传播RBSDV能力的差异。每个群体经饲毒、度过循回期后,选择雌、雄成虫各50头,单头单苗接种1叶1心期健康玉米。接种4 d回收灰飞虱,利用RT-PCR检测带毒率,并调查灰飞虱死亡率;接种43~50 d后调查玉米粗缩病发病率。结果表明:人工饲养55代、23代和8代的灰飞虱群体平均带毒率分别为68.24%、58.93%和62.09%,统计分析表明差异不显著;3个群体平均传毒率分别为31.22%、20.32%和29.91%,55代和8代群体均显著高于23代(P<0.05);3个群体平均死亡率分别为54.19%、65.24%和77.72%,其中55代群体极显著低于8代(P<0.01),二者与23代群体差异不显著。3个群体灰飞虱的带毒率63.09%高于传毒率27.15%,差异极显著(P<0.01)。结论:人工群体饲养至第55代的灰飞虱与仅饲养至第8代的灰飞虱在携带和传播RBSDV方面未发现显著差异,且均保持了较好的能力。
研究简报
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  梨泡状溃疡类病毒的RT-PCR检测及序列分析

  朱慧, 王国平, 杨作坤, 文立红, 陈婕, 徐文兴, 洪霓

  植物病理学报. 2017, 47(4): 558-562. https://doi.org/10.13926/j.cnki.apps.000100

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  利用酵母双杂交筛选与小麦黄花叶病毒P1互作的寄主蛋白

  刘丽娟, 梁乐乐, 戚文平, 孙炳剑, 施艳, 陈琳琳, 李洪连

  植物病理学报. 2017, 47(4): 563-567. https://doi.org/10.13926/j.cnki.apps.000064

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  对小麦黄花叶病毒存在抗性差异的2种小麦品种中eIF4E序列分析

  耿国伟, 顾珂, 于成明, 李向东, 田延平, 原雪峰

  植物病理学报. 2017, 47(4): 568-572. https://doi.org/10.13926/j.cnki.apps.000109

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  瓜类褪绿黄化病毒(Cucurbit chlorotic yellows virus)在湖南省的首次报道及其流行动态研究

  唐鑫, 张德咏, 李凡, 燕飞, 周序国, 张友军, 史晓斌, 刘勇

  植物病理学报. 2017, 47(4): 573-576. https://doi.org/10.13926/j.cnki.apps.000065

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