2018年, 第48卷, 第6期　刊出日期：2018-12-10

  

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病原学
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  内蒙古马铃薯黑胫病病原菌的分离和鉴定

  田艳丽, 胡旭东, 赵玉强, 孙婷, 周家菊, 范加勤, 胡白石

  植物病理学报. 2018, 48(6): 721-727. https://doi.org/10.13926/j.cnki.apps.000183

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  马铃薯是我国的第四大主粮。内蒙古是我国最大的马铃薯生产基地,马铃薯产业是当地农民收入的主要来源。2017年8月,内蒙古锡林郭勒盟部分马铃薯田块发生了一种细菌性黑胫病,发病面积约为200亩,发病率约为20%。发病初期,植株的茎基部变色、发黑,伴有臭味,严重时茎秆腐烂,植株死亡。为明确该地区马铃薯细菌性黑胫病的病原菌种类,本研究对该病原菌进行了分离,并利用生理生化测定,Biolog分析和分子生物学手段将该病原菌鉴定为胡萝卜软腐果胶杆菌巴西亚种(Pectobacterium carotovorum subsp. brasiliense)。据以往报道,我国马铃薯黑胫病主要由黑腐果胶杆菌(P. atrosepticum)和胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种(P. carotovorum subsp. carotovorum)两种病原菌引起,本研究是P. carotovorum subsp. brasiliense引起马铃薯黑胫病在国内的首次报道。

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  黄龙病菌在柑橘枝条上的分布和多样性分析

  陈燕玲, 唐瑞, 刘洋, 邓晓玲, 许美容

  植物病理学报. 2018, 48(6): 728-737. https://doi.org/10.13926/j.cnki.apps.000145

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  柑橘黄龙病是由“Candidatus Liberibacter asiaticus”(CLas)引起的毁灭性病害,在染病植株的叶片和果实上表现出不同症状。但目前还未见在同一植株或枝条上表现不同症状的叶片或果实中的CLas是否存在多样性的报道。本研究分析来自美国佛罗里达与中国广东两地染病柑橘样品,发现佛罗里达的CLas遗传多样性较低。以3对位于CLas短串联重复位点两端的序列为引物,对广东柑橘黄龙病病株的样品进行PCR扩增和PAGE检测,结果发现:同一植株上的CLas多样性高于同一枝条;同一病枝上显不同症状的叶片和果实中的CLas浓度分布不均匀,但成熟病果中CLas的浓度最高。以同一病枝条为一个组,PCR扩增和PAGE检测53个枝条的样品,发现不同组间CLas多样性不一:3对引物扩增条件下分别有4组(7.55%)、7组(13.21%)和11组(20.75%)样品存在组间多样性,推测同一枝条中含有不同的CLas菌株。以上结果说明了CLas在柑橘枝条上的分布规律,为监测我国CLas的多样性提供了科学依据。
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  河北廊坊大豆枯萎病病原镰刀菌的分子鉴定

  张亚朵, 刘佳, 黄文坤, 彭焕, 房庆, 彭德良, 朱英波, 孔令安

  植物病理学报. 2018, 48(6): 738-747. https://doi.org/10.13926/j.cnki.apps.000235

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  为明确河北廊坊中国农科院植保所试验基地大豆孢囊线虫病田内大豆枯萎病病原镰刀菌的种类,对362份罹病枯萎大豆植株进行病原真菌分离,得到335株真菌;使用镰刀菌通用引物鉴定出镰刀菌(Fusarium spp.) 279株,占分离菌株83.3%;镰刀菌特异性引物、测序等分子生物学技术结合形态学特征进一步鉴定镰刀菌种类,鉴定出尖孢镰刀菌(F. oxysporum)189株,占分离菌株56.4%;茄病镰刀菌(F. solani)67株占20.0%、禾谷镰刀菌(F. graminearum)16株占4.8%、木贼镰刀菌(F. equiseti)3株、层出镰刀菌(F. proliferaum)2株、燕麦镰刀菌(F. avenaceum)和厚孢镰刀菌(F. chlamydosporum)各1株;致病性测试结果表明数量最多的尖孢镰刀菌(F. oxysporum)中约92.8%菌株具有不同程度的致病力;这些结果表明该试验基地大豆枯萎病的优势病原菌为尖孢镰刀菌(F. oxysporum);研究结果可为大豆枯萎病的防治提供科学依据,并为大豆孢囊线虫与尖孢镰刀菌复合侵染大豆的研究奠定基础。
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  谷瘟病菌无毒基因AVR1-CO39序列变异及遗传多样性分析

  任世龙, 白辉, 王永芳, 全建章, 董志平, 李志勇, 邢继红

  植物病理学报. 2018, 48(6): 748-757. https://doi.org/10.13926/j.cnki.apps.000364

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  谷瘟病是谷子上毁灭性病害之一,为了探讨不同地区谷瘟病菌群体的遗传多样性,对我国11个省(自治区)171株谷瘟病菌的无毒基因AVR1-CO39进行扩增测序,并利用ClustalX2.0和DnaSP5.0软件对测序结果进行分析。结果表明,171株谷瘟病菌单孢菌株AVR1-CO39的CDS编码区共有40个多态性位点,依据序列之间的核苷酸差异划分为37个单倍型,H1型为绝对优势单倍型。我国11个省份谷瘟病菌群体的AVR1-CO39具有较高的遗传多态性,由于存在较为频繁的基因交流,种群之间没有明显的遗传分化。种群内部的遗传分化是谷瘟病菌遗传分化的主要方式,错配分布检测结果显示进化过程中可能出现群体扩张,并且谷瘟病菌的聚类与地理来源没有显著的关系。研究结果表明,谷瘟病菌无毒基因AVR1-CO39具有较高的变异性,以H1为核心单倍型在不断地变异衍生出新的等位基因类型,并且这种变异衍生趋势并不受地理隔离的影响。研究结果可为谷子抗病品种选育,揭示谷瘟病菌无毒基因与谷子抗病基因之间的互作机制提供理论支持。

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  黄脉爵床棒孢霉叶斑病病原菌及其生物学特性鉴定

  梁萍, 宁平, 简峰, 黄艳花, 王露儒, 陈立和

  植物病理学报. 2018, 48(6): 758-765. https://doi.org/10.13926/j.cnki.apps.000236

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  明确黄脉爵床棒孢霉叶斑病病原菌及其生物学特性,为防控提供理论依据。通过病原菌分离、形态特征观察、致病性测定、rDNA-ITS序列分析、生物学特性及寄主范围测定等研究,证明该病病原菌为山扁豆生棒孢Corynespora cassiicola;菌丝生长及产孢适宜温度20℃~28℃,孢子萌发适宜温度24℃~32℃,菌丝致死温度49℃处理10 min;菌丝生长适宜pH 6~10,产孢适宜pH 4~8,孢子萌发最适pH 8;光暗交替适合菌丝生长与产孢,连续光照可抑制菌丝生长;菌丝生长量由少到多培养基顺序为CA、PCA、PDA、CMA、OA,而PDA上产孢最多;刺伤接种,病菌可侵染喜树(Camptotheca acuminata)等植物。黄脉爵床棒孢霉叶斑病病原为山扁豆生棒孢C. cassiicola,病菌易产孢,寄主广,潜育期短。该病菌侵染黄脉爵床为首次报道。
细胞生物学、生理学、生物化学、分子生物学
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  小麦响应白粉病菌转录因子TaTGA1的表达分析

  徐仲阳, 张宏, 莫启波, 吕士凯, 王长有, 吉万全

  植物病理学报. 2018, 48(6): 766-777. https://doi.org/10.13926/j.cnki.apps.000189

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  由布氏白粉菌(Blumeria graminis f. sp. tritici, Bgt)引起的小麦白粉病是危害我国主产麦区的主要病害之一,防治失时严重影响籽粒产量。抗病基因在小麦应对白粉菌胁迫的应答转录调控过程中起着至关重要的作用,但目前具体的调控机理尚不明确。本研究从小麦品种N9134的RNA-seq Library中获得了白粉菌侵染不同时期差异表达的两个Unigenes,利用反转录PCR(reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR)克隆了两个基因的cDNA全长序列,生物信息学分析表明,两个Unigene是来源于bZIP 家族的TGA 转录因子,分别命名为TaTGA1a和TaTGA1b(GenBank:KU746662和KU746663)。TaTGA1a基因组序列包含8个内含子和9个外显子,编码基因由4AS-5969591转录而来;TaTGA1b包含9个内含子和10个外显子,由4BL-7004698转录而来。TaTGA1a/b编码同一段含有312个氨基酸的多肽,分子量约为35 kD。利用实时荧光定量PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)分析基因在白粉菌胁迫下的表达情况,以明确其表达和生物调控模式,结果表明:用白粉菌生理小种E09接种苗期N9134后TaTGA1a和TaTGA1b均响应了白粉病菌的胁迫。其中TaTGA1b在早期上调表达表现正调控,而TaTGA1a的表达呈现先降后升的特异调控模式。两者对白粉菌胁迫不同的响应转录模式暗示TaTGA1a/b基因在植物对白粉菌侵染的防御过程中可能起着不同的作用,为进一步的功能研究奠定了基础。
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  转录因子MoMsn2的核定位和核输出信号序列参与调控稻瘟病菌的生长发育和致病力

  李新瑞, 张曦, 张正光, 郑小波, 张海峰

  植物病理学报. 2018, 48(6): 778-786. https://doi.org/10.13926/j.cnki.apps.000190

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  稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)引起的稻瘟病是水稻上最重要的真菌病害之一,每年给水稻生产造成10%~30%的产量损失。从分子水平解析该病菌的致病机理,对稻瘟病防控新途径的挖掘具有重要的理论和实践指导意义。前期研究发现,转录因子MoMsn2定位于细胞质和细胞核,通过调控一系列下游基因的表达,控制稻瘟病菌的生长发育和致病性等多个生物学过程。对MoMsn2进行结构域分析,发现其含有2个核定位信号序列NLS1和NLS2、1个核输出信号序列NES和2个锌指蛋白结构域C2H2,但这些结构域的生物学功能尚不清楚。本研究通过构建结构域缺失载体和获得互补菌株的方法对5个结构域在稻瘟病菌的功能进行了分析。结果发现,同时缺失2个C2H2对MoMsn2的功能没有影响,ΔC2H2菌株的表型与野生型和全长互补菌株一致。缺失NLS1能完全恢复ΔMomsn2突变体的营养生长、菌落色素和胁迫应答;部分恢复其产孢量和致病力缺陷。缺失NES仅能部分恢复突变体的生长缺陷;而缺失NLS2完全不能恢复突变体的缺陷,其表型与突变体一致。荧光观察发现,缺失NES和NLS2改变了MoMsn2的核定位模式,而缺失C2H2和NLS1不影响MoMsn2的亚细胞定位。上述结果表明,NLS1、NLS2和NES是MoMsn2中3个重要的结构域,对MoMsn2在稻瘟病菌中行使正常的生物学功能具有重要的调控作用。

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  基于iTRAQ定量蛋白质组技术筛选‘华月’苹果斑点落叶病抗性相关蛋白

  张彩霞, 袁高鹏, 韩晓蕾, 田义, 张利义, 丛佩华

  植物病理学报. 2018, 48(6): 787-798. https://doi.org/10.13926/j.cnki.apps.000192

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  为了探讨苹果叶片抗病相关蛋白的表达特性,进一步解析苹果叶片自身防御反应分子机制,本文以抗病苹果品种‘华月’为试材,采用iTRAQ定量蛋白质组技术分析苹果链格孢菌处理前后,苹果叶片总蛋白差异表达情况。结果表明,与无菌水处理的叶片相比,病原菌接种后的叶片共筛选到433个差异表达蛋白,聚类分析结果较好,其中257个蛋白显著上调,176个蛋白显著下调。进一步开展差异蛋白筛选及功能分析,筛选后的53个蛋白依据功能可划分为7类,分别为代谢过程相关,防御或逆境应答反应相关,蛋白质代谢过程相关,细胞分裂相关,细胞壁修饰相关,细胞过程相关及其他功能未知蛋白。代谢通路分析表明,KEGG共富集到7个结果,64个蛋白在7条通路中得到注释,且这些蛋白对这7条信号通路均具有显著影响(P<0.05)。亚细胞定位分析结果表明,共49个蛋白得到成功定位,其中35个蛋白定位于叶绿体,表明叶片细胞中大量的叶绿体蛋白参与了病原菌胁迫应答反应。其他蛋白中,7个定位于细胞质,3个定位于细胞质膜,其余4个分别定位于细胞壁、胞外、过氧化物酶体及内质网。除了防御或逆境反应相关蛋白,光合作用及其他代谢相关蛋白也参与了苹果叶片细胞的防御反应。病程相关的PR类蛋白中包括3个过氧化物酶类蛋白(PR-9)、1个类甜蛋白(PR-5)及1个MLP样蛋白(PR-10),过敏反应相关的MLP样蛋白在果树应答逆境胁迫的研究中的报道较少,MLP蛋白的差异表达可能也与苹果叶片的防御反应相关。本研究进一步证实了苹果叶片应答链格孢菌胁迫的抗性相关蛋白中,PR类蛋白的差异表达可能是影响苹果叶片细胞抗病反应的关键因子,研究结果为进一步解析果树抗病分子机制提供了参考。
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  高通量测序鉴定柑橘黄化脉明病毒诱导柠檬差异表达microRNA

  牛炳棵, 杨作坤, 王国平, 洪霓

  植物病理学报. 2018, 48(6): 799-809. https://doi.org/10.13926/j.cnki.apps.000238

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  柑橘黄化脉明病毒(Citrus yellow vein clearing virus,CYVCV)是我国新发生的危害柠檬的重要病毒。本研究对接种和未接种CYVCV的柠檬叶片样品进行了高通量小RNA测序,以甜橙基因组作为参考,采用生物信息学软件进行miRNA鉴定和靶基因预测。结果显示CYVCV侵染对13个保守miRNA和12个新鉴定的非保守miRNA的表达具有调控作用,对这些差异表达miRNA的靶基因进行预测和功能分析的结果显示,保守miRNA的靶基因功能在植物逆境反应及光合作用和能量代谢相关通路中具有明显的富集现象,推测与CYVCV侵染柠檬植株及诱导病害症状表现有关,而多数新鉴定的非保守miRNA的靶基因功能未能注释到KEGG通路。采用实时荧光定量PCR对部分miRNA的表达水平进行了分析,结果表明miRNA的表达水平在接种CYVCV后30~90 d呈时间动态变化。研究结果为进一步揭示CYVCV与柠檬互作机制提供了重要信息。

致病性与抗病性遗传
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  苹果炭疽叶枯病菌致病相关基因CgNVF1的功能初步分析

  张俊祥, 王美玉, 徐成楠, 周宗山

  植物病理学报. 2018, 48(6): 810-816. https://doi.org/10.13926/j.cnki.apps.000148

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  苹果炭疽叶枯病是主要由胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)引起的一种苹果重要叶部病害,严重威胁着苹果树的生长。本研究从构建的苹果炭疽叶枯病菌T-DNA突变体库中筛选获得一株致病力缺失的突变菌株A3083,采用hiTAIL-PCR方法克隆了该突变体T-DNA插入位点的右翼序列;通过与胶孢炭疽菌基因组序列比对分析,发现T-DNA插入位点位于1个预测的CGGC5_9603基因内,并将该基因命名为CgNVF1。CgNVF1基因全长2 252 bp,含有2个内含子,编码709个氨基酸。CgNVF1定位于细胞质,在苹果炭疽叶枯病菌菌丝、分生孢子和附着胞中均有表达。通过构建CgNVF1敲除菌株和CgNVF1互补菌株,并结合表型分析,证实CgNVF1基因在苹果炭疽叶枯病菌附着胞形成及致病中具有重要的作用。
植物病害及其防治
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  河北省设施番茄灰霉病菌对啶酰菌胺和咯菌腈的敏感性

  赵建江, 路粉, 吴杰, 马志强, 韩秀英, 王文桥

  植物病理学报. 2018, 48(6): 817-821. https://doi.org/10.13926/j.cnki.apps.000135

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  为明确河北省设施番茄灰霉病菌对啶酰菌胺和咯菌腈的敏感性,2013—2016年,采用菌丝生长速率法测定了采自河北省八个地区的2 425株灰霉病菌对啶酰菌胺和咯菌腈的敏感性。2013—2016年监测数据显示,河北省设施番茄灰霉病菌对啶酰菌胺和咯菌腈的敏感性呈下降趋势。2016年从河北省不同地区采集的番茄灰霉病菌对啶酰菌胺具有相似的敏感性,且对啶酰菌胺产生了低水平的抗性,仅在唐山地区检测到了啶酰菌胺的高抗菌株;而不同地区采集的灰霉病菌对咯菌腈的敏感性具有差异,但均为咯菌腈的敏感菌株。因此,啶酰菌胺和咯菌腈仍可用于番茄灰霉病的防治,但应严格控制其使用频率,监测灰霉病菌对其敏感性变化动态。

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  烟草赤星病菌嘧菌酯敏感与抗性菌株的代谢表型差异分析

  汪汉成, 黄艳飞, 陈兴江, 陈乾丽, 李忠

  植物病理学报. 2018, 48(6): 822-832. https://doi.org/10.13926/j.cnki.apps.000140

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  为了解烟草赤星病菌(Alternaria alternata)嘧菌酯抗性菌株与敏感菌株在代谢表型上的差异,采用Biolog代谢表型技术比较了抗性菌株(6-5和6-11)和敏感菌株(J6)的950种代谢表型。结果表明,抗性菌株和敏感菌株在代谢表型上基本一致,2个抗性菌株均不能代谢糖酵解中的氮源D-甘露糖胺,抗性菌株6-11还不能代谢尿素循环中的氮源L-鸟氨酸。烟草赤星病菌能代谢24.74%、85.26%、97.14%、89.83%的供试碳、氮、硫、磷源;具有广泛渗透压和pH适应能力;具有脱羧酶活性而无脱氨酶活性;能在高达10%氯化钠、6%氯化钾、5%硫酸钠、20%乙二醇、6%甲酸钠、6%尿素、12%乳酸钠、200 mmol·L^-1 磷酸钠、100 mmol·L^-1硫酸铵、100 mmol·L^-1硝酸钠和20 mmol·L^-1亚硝酸钠的渗透液中正常代谢,不能在20~200 mmol·L^-1的苯甲酸钠渗透液中代谢;其pH适应范围为3.5~10.0,最适约为6.0。研究结果有助于了解烟草赤星病菌的营养需求特性、渗透压和pH环境适应力,同时从代谢表型上揭示了赤星病菌对嘧菌酯抗性的潜在机理。
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  西瓜花叶病毒抗血清制备及其应用

  冀树娴, 王姝雯, 王健, 李向东, 朱天生, 田延平

  植物病理学报. 2018, 48(6): 833-837. https://doi.org/10.13926/j.cnki.apps.000237

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  西瓜花叶病毒(Watermelon mosaic virus, WMV)是危害葫芦科作物的重要病毒。制备特异性强、效价高的抗血清对快速准确检测和鉴定WMV具有重要意义。本研究将WMV外壳蛋白(Coat protein,CP)基因克隆到原核表达载体pEHISTEV获得pEHISTEV-WMV-CP。将pEHISTEV-WMV-CP转化大肠杆菌Rosetta,经IPTG诱导,成功表达出分子量约为36 kDa的蛋白,与预期WMV CP大小一致。切胶回收WMV CP,与等体积弗氏不完全佐剂充分乳化后免疫健康新西兰大白兔。Western blotting结果表明,制备的抗血清与WMV CP有反应,与同属的番木瓜环斑病毒(Papaya ringspot virus,PRSV)、马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)、小西葫芦黄花叶病毒(Zucchini yellow mosaic virus, ZYMV)和烟草花叶病毒属的黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)均无反应。酶联免疫吸附测定(PTA-ELISA)结果表明,本研究制备的WMV抗血清效价为1∶8 192,并且能够检测稀释512倍的病毒汁液。利用该抗血清对田间采集的10个RT-PCR检测为阳性的样品进行检测,全部呈现阳性。本研究利用大肠杆菌表达的CP制备的WMV抗血清具有较高的特异性和灵敏度。研究结果为WMV的快速检测和鉴定奠定了基础。
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  菌株S01324对燕麦孢囊线虫的杀线活性及其种类鉴定

  梁晨, 黄晨, 宋雯雯, 李宝笃, 赵洪海

  植物病理学报. 2018, 48(6): 838-846. https://doi.org/10.13926/j.cnki.apps.000239

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  燕麦孢囊线虫是我国小麦孢囊线虫病的重要病原之一,为寻找适宜的生防菌株,本研究通过室内生测、室内杯栽试验以及田间管栽试验对菌株S01324的菌体和发酵滤液进行了杀线虫活性测定。室内生测结果发现,菌株S01324对孢囊的寄生率达到100.0%;处理8 d后,菌株发酵滤液原液对卵孵化的抑制率为98.8%,发酵滤液稀释16倍对卵孵化的抑制率仍能达到42.0%;处理24 h后发酵滤液原液对二龄幼虫(J2)的校正死亡率达到100.0%,而处理6 d后发酵滤液8倍稀释液也能杀死全部J2。杯栽试验发现,发酵滤液原液和麦粒培养物处理后,孢囊减少率分别为50.6%和62.1%。管栽试验发现,发酵滤液原液和麦粒培养物处理后,孢囊减少率分别为60.8%和58.9%。通过形态学和序列分析,菌株S01324鉴定为绳状青霉(Penicillium funiculosum)。这是关于绳状青霉杀线活性的首次报道。
研究简报
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  3种甘薯病毒多重RT-PCR检测方法的建立及应用

  姜珊珊, 冯佳, 吴斌, 张眉, 王升吉, 辛志梅, 任建雯, 陈琳琳, 辛相启

  植物病理学报. 2018, 48(6): 847-851. https://doi.org/10.13926/j.cnki.apps.000231

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