2020年, 第50卷, 第2期　刊出日期：2020-04-10

  

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病原学
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  香蕉枯萎病菌1号小种分泌蛋白与效应子的预测与分析

  何艳秋, 颜瑞, 蒙姑, 杨文静, 王振中, 李云锋, 聂燕芳

  植物病理学报. 2020, 50(2): 129-140. https://doi.org/10.13926/j.cnki.apps.000458

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  由尖孢镰刀菌古巴专化型1号小种(Fusarium oxysporum f. sp. cubense race 1,Foc1)引起的香蕉枯萎病是香蕉生产上的毁灭性病害之一。分泌蛋白作为一类重要致病因子,在Foc1与香蕉互作过程中起着重要作用。本文利用SignalP、WoLF PSORT、TargetP、TMHMM和big-PI Predictor等生物信息学软件,对Foc1全基因组编码的15 438条蛋白质氨基酸序列进行了分泌蛋白及效应子的预测分析。结果表明,Foc1全基因组编码蛋白中有988个经典分泌蛋白,占编码蛋白总数的6.40%。蛋白特征分析表明,其氨基酸长度主要集中在101~500个氨基酸(占总数的71.26%),信号肽长度集中在17~20个氨基酸(占61.94%),信号肽切割位点以SPaseⅠ型为主(占92.91%)。碳水化合物酶类(CAZymes)分析表明,有281个分泌蛋白属于CAZymes,其中以糖苷水解酶家族最多。对细胞壁降解酶类分析表明,有27个分泌蛋白属于纤维素降解酶类,73个属于果胶降解酶类,42个属于木聚糖降解酶类。以氨基酸长度≤400和半胱氨酸残基数≥4为筛选条件,发现Foc1经典分泌蛋白中有378个候选效应子。qRT-PCR分析表明,7个候选效应子均在香蕉组织提取物诱导后获得上调表达,从实验角度证实了其为真正的效应子。
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  大麦黄矮病毒PAV青海分离物运动蛋白抗血清制备及其与同属BYDVs的血清学关系

  胡汝检, 赵添羽, 左登攀, 王颖, 张宗英, 韩成贵

  植物病理学报. 2020, 50(2): 141-146. https://doi.org/10.13926/j.cnki.apps.000463

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  大麦黄矮病毒(Barley yellow dwarf viruses, BYDVs)属于黄症病毒科,主要以蚜虫为介体进行传播,引发多种作物减产或绝收。本文将BYDV-PAV青海分离物的运动蛋白(MP)克隆到原核表达载体pDB-MBP-His上,转化大肠杆菌Rosetta(DE3),在IPTG诱导下表达蛋白分子量约为61 kDa的融合蛋白。将纯化后的蛋白作为抗原免疫‘新西兰’大白兔制备抗血清,Western blot检测本生烟瞬时表达带标签的MP蛋白,结果显示该抗血清效价为1∶32 000,灵敏度达1∶256,且该抗血清可与相差34个氨基酸的PAV015株系以及隶属于黄症病毒属其他的BYDVs(PAS、MAV、KerⅡ和KerⅢ)MP均能发生强烈的血清学反应,具有血清学相关性。本研究制备的大麦黄矮病毒PAV青海分离物运动蛋白多克隆抗体为探索BYDV-PAV运动蛋白的功能以及作用机制打下了基础。
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  侵染四川辣椒的番茄斑萎病毒和辣椒轻斑驳病毒的小RNA测序检测及鉴定

  韩帅, 张河庆, 吴婕, 李洪浩, 席亚东

  植物病理学报. 2020, 50(2): 147-154. https://doi.org/10.13926/j.cnki.apps.000417

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  调查发现四川省汶川县当地辣椒的病毒病严重且症状多样,病样粗提液摩擦接种辣椒、矮牵牛和三生烟,出现辣椒系统性花叶焦枯和茎尖坏死,指示植物表现局部枯斑。对3个不同症状的病果进行sRNA深度测序鉴定,发现均含有番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus,TSWV)和辣椒轻斑驳病毒(Pepper mild mottle virus,PMMoV)。通过RT-PCR技术进行验证,结果显示所有病样的果皮和部分新鲜种子以及回接寄主的病叶均检测到TSWV和PMMoV,表明该地辣椒病毒病是由TSWV和PMMoV复合侵染引起。这是TSWV侵染四川辣椒的首次报道。分别基于TSWV N基因序列和PMMoV CP基因序列构建系统发育树,汶川分离物TSWV-WC(MK468469)与贵州分离物(KP684518)亲缘关系最近,PMMoV-WC(MK408614)与北京分离物(AY859497)亲缘关系最近。推测该地辣椒病毒病可能与品种引进有关。
细胞生物学、生理学、生物化学、分子生物学
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  条锈菌效应子Pst30抑制植物的胼胝质和活性氧积累

  王力坤, 樊昕, 汤春蕾, 康振生, 王晓杰

  植物病理学报. 2020, 50(2): 155-163. https://doi.org/10.13926/j.cnki.apps.000315

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  条形柄锈菌小麦专化型(Puccinia striiformis f. sp. tritici,Pst)导致的小麦条锈病严重威胁着我国的小麦生产安全。解析病菌的致病机理,对开发病害防控技术与策略具有重要的指导意义。研究发现效应子是病菌重要的致病因子,揭示效应子调控寄主免疫机制可加深对病菌的认知。本课题组前期在全基因组筛选条锈菌效应子中获得了一个候选效应子基因Pst30,该基因所编码的蛋白N-端含有分泌肽,无明显功能结构域。qRT-PCR分析显示Pst30在条锈菌侵染小麦后12 h诱导表达,72 h诱导表达至高峰。利用农杆菌侵染在烟草中瞬时表达Pst30^ΔSP-GFP融合蛋白,发现Pst30^ΔSP定位在细胞质。在烟草中瞬时表达该效应子能够显著抑制Bax诱导的细胞坏死。利用细菌的Ⅲ型分泌系统在小麦中瞬时表达Pst30,能够抑制荧光假单胞杆菌引起的胼胝质积累,导致由无毒性条锈菌小种CYR23引起的小麦过敏性坏死面积和活性氧积累减少,菌丝面积和长度增加。推测小麦条锈菌效应子Pst30可抑制寄主植物的PTI(PAMP-triggered immunity, PTI)和ETI(Effectors-triggered immunity, ETI),促进自身的侵染。
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  PstVosA1转录因子基因在调控小麦条锈菌耐高温反应中的生物学功能分析

  李雪, 吴艳琴, 王凤涛, 冯晶, 王金鑫, 贾秋珍, 刘林, 刘秀峰, 徐世昌, 蔺瑞明

  植物病理学报. 2020, 50(2): 164-172. https://doi.org/10.13926/j.cnki.apps.000316

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  小麦条锈病是典型的冷凉生态区气传真菌病害,病原菌在越夏易变区(即秋季菌源基地)的越夏情况决定了冬季繁殖区条锈菌的初侵染菌源。小麦条锈病的发生流行极易受到温湿度关键气象因子的影响。近年来的调查研究发现,我国小麦条锈菌越夏海拔下限逐年下降,且越夏区范围进一步扩大,说明条锈菌耐高温胁迫能力增强,给未来小麦条锈病流行规律研究及制定防治策略带来了全新挑战。真菌特有的Velvet转录因子家族中VosA基因参与了真菌生长发育和次生代谢的调控,但关于该转录因子在条锈菌耐高温性中的作用却知之甚少。实时荧光定量PCR分析发现,温度敏感菌系蓬9和耐高温菌系A4在侵染寄主过程中PstVosA1基因均受高温胁迫诱导表达,但耐高温菌系PstVosA1相对表达水平明显高于温度敏感菌系蓬9。利用寄主诱导的基因沉默技术(HIGS)沉默小麦条锈菌耐高温菌系A4中的PstVosA1基因能显著降低在高温(21℃)接种条件下的平均发病严重度、孢子堆密度和生物量。研究结果说明PstVosA1基因正调控小麦条锈菌耐高温胁迫反应过程,增加该基因的表达水平,有利于增强小麦条锈菌耐高温性。
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  马铃薯晚疫病菌效应子PITG_16427.2的基因序列分析及功能验证

  王娇, 高存钢, 曹伟琳, 丁新华, 储昭辉

  植物病理学报. 2020, 50(2): 173-182. https://doi.org/10.13926/j.cnki.apps.000413

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  马铃薯晚疫病的病原是致病疫霉菌(Phytophthora infestans),该病原菌在侵染马铃薯过程中分泌大量RxLR型效应子,但目前绝大多数RxLR效应子的功能和作用机制尚不明确。本研究成功克隆了致病疫霉菌的一个RxLR效应子PITG_16427.2,在本氏烟中瞬时表达PITG_16427.2,发现该效应子能够抑制6种激发子(INF1、PsojNIP、BAX、SIF2、Avh238、Avh241)激发的植物免疫反应。进一步研究发现,效应子PITG_16427.2在晚疫病菌侵染马铃薯早期上调表达。在15个致病疫霉菌株和3个同属菌株中克隆该基因,克隆到氨基酸序列一致性超过93%的同源基因,这些同源基因均能在本氏烟中抑制INF1和Avh241引起的HR,揭示了该效应子在病原卵菌中序列和功能的高度保守性。在本氏烟和马铃薯感病品种Désirée中瞬时表达PITG_16427.2,发现该效应子能够显著促进晚疫病菌的侵染。通过qRT-PCR方法检测发现,乙烯信号的相关基因ERF1显著上调,而水杨酸信号相关基因PR1b显著下调,表明PITG_16427.2在晚疫病菌侵染过程中可抑制寄主的SA信号途径,促进晚疫病菌侵染。因此,RxLR型效应子PITG_16427.2是致病疫霉菌中一个重要的侵染致病因子。

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  水稻VQ37基因的克隆及其在病原侵染下的表达

  陶宗, 王海华, 肖婷, 周定港, 申权, 彭喜旭

  植物病理学报. 2020, 50(2): 183-192. https://doi.org/10.13926/j.cnki.apps.000317

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  VQ蛋白作为转录辅助蛋白,在植物的生长、发育和抗逆等生理过程中发挥重要的调节功能。本研究采用RT-PCR从水稻叶片中克隆了VQ37基因的完整cDNA序列。VQ37 cDNA长622 bp,具有长为546 bp的完整开放读码框,编码蛋白质长181个氨基酸,具有FxxxVHxVTG的VQ基序变体。系统进化分析表明,水稻VQ37与短花药野生稻(Oryza brachyantha)、大麦(Hordeum vulgare)和Dichanthelium oligosanthes等禾本科植物亲缘关系近;除水稻旁系同源物VQ39外,VQ37与短花药野生稻中的XP 015699121亲缘关系最近。原生质体瞬间表达实验证实VQ37定位在细胞核中。荧光定量PCR分析显示,VQ37基因的组织特异性表达和诱导表达结果与启动子顺式元件预测基本一致。VQ37在叶片中的表达丰度最高,其次是叶鞘、茎、穗、根和花,在胚和胚乳中无表达。VQ37受纹枯病菌(Rhizoctonia solani)和稻瘟病菌(Magnaporthe oryza)显著诱导,而不受白叶枯细菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae)诱导;与此一致的是,VQ37受真菌病原相关模式(PAMP)分子几丁质寡糖快速诱导,而不受细菌鞭毛蛋白flg22影响。茉莉酸甲酯和乙烯利能显著诱导VQ37的表达,而水杨酸对其表达无明显影响。上述结果提示,VQ37可能调控水稻对稻瘟病菌和纹枯病菌防御反应,这种调节作用可能依赖于茉莉酸/乙烯介导的信号途径,而与水杨酸信号途径无关。该研究为阐释水稻VQ37基因在水稻抗病反应中的调节功能提供了基础。
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  稻瘟病菌CAAX蛋白酶MoRce1的功能研究

  吴艺委, 李爽, 周睿晗, 苏峻冬, 豆献英, 王宗华

  植物病理学报. 2020, 50(2): 193-202. https://doi.org/10.13926/j.cnki.apps.000318

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  蛋白质的翻译后异戊烯化修饰(CAAX修饰)能够介导真核生物中许多重要蛋白质的亚细胞定位以及蛋白与蛋白间的相互作用。稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)引致的稻瘟病是水稻最重要病害之一,造成全球水稻严重减产。为深入了解稻瘟病菌致病机理,更好地防控稻瘟病,我们研究了异戊烯修饰是否影响稻瘟病菌的生长发育和致病性。首先从稻瘟病菌基因组数据库中鉴定到一个稻瘟病菌的异戊烯蛋白酶MoRce1,同源比对发现MoRce1保守结构域在各物种之间变化较大,猜测在不同物种中该蛋白可能出现了功能分化。经同源重组方法敲除MoRCE1基因,发现MoRCE1缺失突变体在胁迫培养条件下细胞壁完整性明显缺陷,但是对营养生长、产孢、萌发以及致病性没有明显影响,说明MoRce1蛋白可能通过参与稻瘟病菌细胞壁合成相关蛋白的异戊烯化修饰进而影响该菌细胞壁的完整性,其具体机制还有待深入研究。
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  木尔坦棉花曲叶病毒编码蛋白的亚细胞定位分析

  尚鹏祥, 胡汝检, 陈家盛, 郑信诗, 杜振国, 张洁, 吴祖建

  植物病理学报. 2020, 50(2): 203-210. https://doi.org/10.13926/j.cnki.apps.000414

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  木尔坦棉花曲叶病毒(Cotton leaf curl Multan virus,CLCuMV)是典型的单组分双生病毒,并伴随β卫星分子,是棉花曲叶病的主要病原之一。本研究利用农杆菌介导的瞬时表达系统,将CLCuMV及其卫星分子编码的7个病毒蛋白在本氏烟表皮细胞中表达。通过激光共聚焦显微镜观察发现:V1、C2和C3定位于细胞核;C1和βC1定位在细胞核以及细胞质或细胞膜上,并且在细胞质中形成丝状结构;V2和C4主要定位在细胞质或细胞膜上,细胞核也有微量表达,V2可形成大小不一的颗粒状聚集体结构,C4在细胞膜上可见点状聚集体结构。同时,利用RT-PCR和Western blot对病毒各基因的转录和表达水平进行了分析。CLCuMV编码蛋白的亚细胞定位为蛋白功能的进一步研究提供重要理论依据。
致病性与抗病性遗传
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  水稻穗部农艺性状与稻曲病抗性的相关性分析

  陈天琪, 李衫衫, 吕楚阳, 梁五生, 胡东维

  植物病理学报. 2020, 50(2): 211-217. https://doi.org/10.13926/j.cnki.apps.000409

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  人工接种试验和田间多年自然发病调查发现,目前生产上应用的水稻品种均感稻曲病;但在自然条件下,不同水稻品种稻曲病的发生程度存在较大差异,可以人为的分为多病粒高感品种和寡病粒相对抗病的品种。为了探究水稻穗部性状与其病害抗性间的关系,本文对孕穗期不同阶段的不同水稻品种的穗部性状进行了比较分析。结果发现表型为多病粒的高感多病粒品种与表型为寡病粒的相对抗病的品种之间在穗子大小、小花密度、穗鞘闭合程度和密封性、旗叶面积等方面均存在明显差异,寡病粒相对抗病的水稻品种穗鞘闭合程度优于高感多病粒品种。
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  云南省水稻细菌性条斑病菌的致病型划分和水稻抗性资源的鉴定

  杨俊, 王星, 王彦芳, 刘棋, 汪娅婷, 张晋豪, 魏兰芳, 姬广海

  植物病理学报. 2020, 50(2): 218-227. https://doi.org/10.13926/j.cnki.apps.000411

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  为明确云南省水稻细菌性条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzicola, Xoc)的致病力分化以及不同类型水稻品种对Xoc的抗感特性,通过针刺接种法将云南省8个稻区采集的86株Xoc菌株,接种于6个携带不同抗性基因的水稻鉴别品种(IRBB4、IRBB5、IRBB14、IRBB18、IRBB21和IR24)。根据这些菌株在鉴别品种上的毒力差异进行了UPGMA聚类分析,将其划分为9个致病型(Ⅰ型 ~ Ⅸ 型)。其中,Ⅰ型为优势菌群,分布频率为50.5%。对不同稻区的优势菌群进行分析,发现云南省各稻区Xoc的致病型呈多样性分布,以强毒力的Ⅰ型为高频率致病型。选用 Ⅰ 型、Ⅱ 型和 Ⅵ 型代表菌株对云南省的80个主栽和区试水稻品种进行抗性评价,对3个致病型表现抗性的材料比例分别为30.0%、35.0%和57.5%。筛选出9个对3种致病型都表现为抗性的品种,其中“Deyou16”和“Changgui2”表现为高抗。研究结果可为云南省防治水稻细菌性条斑病的水稻区域性布局和抗性品种的利用提供理论依据。
细胞生物学、生理学、生物化学、分子生物学
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  基底硬度对玉米大斑病菌主要侵染结构和黑色素沉积的影响

  刘炳辉, 周丽宏, 刘宁, 贾慧, 曹志艳, 董金皋

  植物病理学报. 2020, 50(2): 228-237. https://doi.org/10.13926/j.cnki.apps.000320

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  基底硬度是调控植物病原真菌侵染结构形成的重要物理信号。为探讨基底硬度对玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)侵染能力的影响,本研究利用不同硬度的PDA培养基进行模拟试验,并在不同叶龄的玉米叶片上进一步验证,结果表明,基底硬度越大,气生菌丝越少,菌丝分枝越多;硬基底上,病菌的分生孢子产量高,是软基底和适中硬度基底上的29.93和6.82倍,且硬基底上病菌附着胞形成率显著高于软基底。研究发现,在硬基底上生长的大斑病菌菌落颜色较深,菌丝中黑色素含量高。利用实时荧光定量PCR技术分析病菌黑色素合成途径中相关基因的表达情况,发现在硬基底上StMR1、StPKS、St4HNR、StSCD、St3HNR、StLAC1、StLAC2和StLAC4基因的相对表达量均高于软基底。上述结果说明,基底硬度影响了病菌形态结构的发育,导致了与侵染相关的黑色素含量的变化和侵染结构的形成,研究结果为探究植物病原真菌的侵染机制和病害防控提供了理论依据。
实验方法
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  樱桃灰霉病菌LFD-RPA快速检测方法的建立

  王燕, 王春伟, 王琳, 荆琦, 高海馨, 余廷濠, 王美琴, 张作刚, 王建明

  植物病理学报. 2020, 50(2): 238-245. https://doi.org/10.13926/j.cnki.apps.000453

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  灰霉病是樱桃的主要病害,由灰葡萄孢(Botrytis cinerea)侵染所致。该病菌可为害樱桃的花、叶、果实等多个部位,尤其在樱桃生长中后期及贮藏期发病率极高,危害严重。依据樱桃灰霉病菌内转录间隔区(ITS)序列设计引物,建立了樱桃灰霉病菌的重组酶聚合酶扩增结合侧流层析试纸条(LFD-RPA)检测方法。结果表明,该方法检测条件为37℃扩增30 min,能特异性地检测灰葡萄孢,灵敏度为100 fg·μL^-1,略低于常规PCR(10 fg·μL^-1)和荧光定量PCR(7.43 fg·μL^-1);检测方法用时短,PRA扩增仅需30 min,LFD检测仅需10 min。本研究建立的快速检测方法可用于樱桃灰霉病菌的实时监测及病害的田间快速诊断。
研究简报
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  云南、广西三七黑斑病病原链格孢菌的鉴定

  何迟, 王慧玲, 金鑫, 靳百慧, 粟珊, 段亚男, 何霞红

  植物病理学报. 2020, 50(2): 246-250. https://doi.org/10.13926/j.cnki.apps.000412

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  黄瓜花叶病毒浙江白术分离物全基因组序列测定与分析

  宋嘉伟, 侯盼盼, 费莉玢, 龙奎, 刘颖, 高诗琪, 苏秀, 马良进

  植物病理学报. 2020, 50(2): 251-254. https://doi.org/10.13926/j.cnki.apps.000416

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