2022年, 第52卷, 第5期　刊出日期：2022-10-10

  

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病原学
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  苜蓿轮枝菌的生物学特性分析及ATMT遗传转化体系的建立

  贾瑞芳, 王乐, 于飞, 张园园, 林克剑

  植物病理学报. 2022, 52(5): 727-737. https://doi.org/10.13926/j.cnki.apps.000601

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  为了揭示苜蓿轮枝菌Verticillium alfalfae的生物学特性及其致病机理,在室内条件下测定不同温度、pH值、碳源和氮源对菌株Ms198的生长速率和产孢量的影响,同时利用农杆菌转化法(Agrobactirium tumfacience-mediated transformant,ATMT)将带有潮霉素(Hygromycin,Hyg)抗性标记和绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)报告基因的双元载体转入苜蓿轮枝菌的分生孢子,获得147株阳性转化子,以野生型菌株为对照,对挑取的15株阳性转化子的菌落形态、生长速率、产孢量、孢子萌发率、粗毒素分泌量和致病力进行研究。结果表明,苜蓿轮枝菌具有较宽的温度和酸碱度适应范围,最适生长和产孢温度分别为25 ℃和20 ℃,最适生长pH值为6 ~ 9,最适产孢pH值为9。可以利用多种碳、氮源,最适生长的碳、氮源分别为可溶性淀粉和牛肉膏,最适产孢的碳、氮源分别为D-牛乳糖和胰蛋白胨。与野生型菌株相比,15株供试转化子中有66.67%的转化子在菌落形态方面与野生型菌株无明显差别,而其生长速率、产孢量和孢子萌发率均有不同程度的降低。在产毒能力和致病力方面,1株转化子的粗毒素分泌量显著高于野生型菌株,9株显著低于野生型菌株,其余5株与野生型菌株无显著差异;4株转化子的致病力显著低于野生型菌株,其余11株转化子的致病力与野生型菌株均无显著差异。研究结果表明,转化子的生物学特性以及产毒能力和致病力,随外源基因插入位点的随机性而有所变化。
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  生姜群结腐霉对烟草的致病性及其一种类Nep1蛋白对烟草的毒性作用分析

  薛太强, 汪伦记, 陈思桥, 谢文达, 陈一帆, 张金凤, 周冬梅, 魏利辉

  植物病理学报. 2022, 52(5): 738-754. https://doi.org/10.13926/j.cnki.apps.000621

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  烟草(Nicotiana tabacum)作为重要的经济作物在世界范围内广泛种植。群结腐霉(Pythium myriotylum)引起的烟草苗期根腐病是影响烟草产量的重要因素。对分离自我国3个主要烟草种植区(重庆、河南、四川)生姜上的6株群结腐霉菌(ChY1、ChY3、HNP1、HNP10、SiL1和SiL2)进行烟草致病力及致病因素分析。多位点序列分析(Multilocus Sequence Analysis, MLSA)显示6菌株处于4个不同的分组,具有一定的遗传差异。幼苗实验结果表明,6株群结腐霉菌均能侵染三生烟及其他3种商品化烟草品种(红花大金元、云烟87和K326),同种菌株对不同品种烟草的致病性差异不显著(P>0.05)。盆栽实验和离体叶片实验与幼苗实验结果一致,6株群结腐霉菌均能侵染三生烟,而且致病力存在差异,其中分离自四川的SiL1和SiL2致病性最强。异源产生的群结腐霉NLP蛋白(Nepl-like proteins)能导致三生烟叶片细胞坏死,表明群结腐霉产生的NLP蛋白是侵染烟草的致病因素之一。

细胞生物学、生理学、生物化学、分子生物学
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  稻瘟病菌与丽江新团黑谷苗期互作叶片代谢产物分析

  潘争艳, 姚继攀, 解文孝, 褚晋, 闫晗, 董立强, 李建国, 马亮, 白元俊

  植物病理学报. 2022, 52(5): 755-762. https://doi.org/10.13926/j.cnki.apps.000498

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  为了从代谢产物角度解析稻瘟病菌诱导 ‘丽江新团黑谷’(LTH)叶片的感病机理,本研究采用GC-MS检测稻瘟病菌接种后LTH叶片和对照LTH叶片的代谢产物,利用在线软件进行处理之间代谢产物的主成分分析(Principal component analysis,PCA)、偏最小二乘判别分析(Partial least-squares discriminantion analysis, PLS-DA)和差异代谢通路分析。结果表明:GC-MS定性到LTH叶片中331种代谢物,PCA和PLS-DA分析可以将接种叶片与对照叶片的代谢产物分开,从接种后2 d开始,随着接种时间延长接种叶片与对照叶片的代谢产物相距越来越远。稻瘟病菌诱导LTH叶片中1-单油酸、胆固醇、葡萄糖酸、别嘌呤醇、黄嘌呤、肌苷和菊粉糖相对含量显著上调(VIP>1.0);15条代谢途径受到影响,其中赖氨酸降解、苯丙氨酸代谢和甜菜素生物合成的-lnP值随着接种时间延长逐渐增大。推测,稻瘟病菌侵染导致LTH叶片中胆固醇等含量显著上调,赖氨酸降解、苯丙氨酸代谢和甜菜素生物合成代谢受到干扰,进而促使叶片组织坏死。
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  白条黄单胞菌侵染对蔗叶和蔗茎组织超微结构的影响

  李奕莎, 李美霖, 杜金霞, 张木清

  植物病理学报. 2022, 52(5): 763-768. https://doi.org/10.13926/j.cnki.apps.000772

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  本研究利用普通光学显微镜、透射电镜和扫描电镜观察白条黄单胞菌[Xanthomonas albilineans (Ashby) Dowson]侵染后菌体定殖及对甘蔗叶片和蔗茎组织超微结构的影响。结果表明,白条黄单胞菌侵染后叶片的薄壁组织细胞膜裂解,木质部生长受到抑制。叶绿体形状多近圆形,基质片层解体,被膜破坏呈松弛状态,出现大量的原生质膜。扫描电镜可见白条黄单胞菌存在于各个叶肉细胞中,同时在维管束中也发现菌体定殖,特别是木质部导管。蔗茎的维管束被白条黄单胞菌堵塞,使得蔗茎木质化、木栓化严重。本研究有助于理解白条黄单胞菌对甘蔗叶片和蔗茎细胞内细胞器损伤的形态破坏,为白条病防治提供超微形态学依据。
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  大丽轮枝菌外切葡聚糖酶VdCBH1在毕赤酵母中的表达与酶活分析

  吴思源, 刘璐, 王琦, 潘国强, 刘海洋, 马伯军, 苏晓峰, 程红梅

  植物病理学报. 2022, 52(5): 769-781. https://doi.org/10.13926/j.cnki.apps.000771

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  为了探究大丽轮枝菌外切葡聚糖酶VdCBH1(exoglucanase)的酶活与催化机理,本研究在生物信息学分析的基础上,以大丽轮枝菌V991菌株为材料克隆了VdCBH1基因,进一步构建了pPIC9-VdCBH1重组质粒并转入毕赤酵母中进行表达,测定了重组VdCBH1蛋白的外切葡聚糖酶活性;将预测的VdCBH1催化残基位点进行突变,随后通过SDS-PAGE分析了重组VdCBH1蛋白及其催化残基位点突变蛋白的表达情况,并检测了VdCBH1催化残基位点突变前后的酶活变化。结果表明,VdCBH1基因编码区全长1 356 bp,编码451个氨基酸,蛋白理论分子量大小为48.574 kDa,理论等电点为4.29,N端前17个氨基酸为信号肽序列。保守结构域和进化树分析表明,VdCBH1蛋白含有GH7_CBH_EG保守结构域,该结构域是糖基水解酶7家族(Glycosyl hydrolase family 7,GH7)所特有的,与尖端赛多孢子菌(Scedosporium apiospermum)的外切葡聚糖酶蛋白亲缘关系最近。重组VdCBH1蛋白具有典型的外切葡聚糖酶活性,而Glu233催化残基单突变与Glu228、Asp230和Glu233催化残基三突变蛋白的酶活明显下降。这表明催化残基Glu233在外切葡聚糖酶活性中发挥更为重要的作用,Glu228、Asp230则可能在其中起协同作用。本研究为进一步揭示VdCBH1蛋白的催化机制奠定了理论基础。
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  禾谷镰刀菌脂质转运蛋白Vps13的功能分析

  迟浩文, 韩雪勤, 殷复伟, 商明清, 张莉, 于金凤, 梁元存

  植物病理学报. 2022, 52(5): 782-790. https://doi.org/10.13926/j.cnki.apps.000597

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  Vps13蛋白家族是真核生物中高度保守的一类脂质转运蛋白,其在丝状真菌中的功能尚不清楚。小麦赤霉病主要由禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)引起,是小麦最重要病害之一。禾谷镰刀菌含有酿酒酵母VPS13的一个同源基因FgVPS13。通过同源重组的方法获得禾谷镰刀菌FgVPS13敲除突变体。研究表明,FgVPS13敲除突变体出现生长、产孢和有性生殖的缺陷。FgVPS13敲除突变体在小麦胚芽鞘和麦穗上的致病力下降,产生的脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol, DON)毒素含量也明显降低。而且,FgVPS13抑制线粒体自噬。总之,FgVPS13参与调控禾谷镰刀菌菌丝生长、无性和有性生殖、致病力和线粒体自噬。
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  miR535-3p调控水稻纹枯病抗性的功能研究

  张朝阳, 冯涛, 左示敏, 欧阳寿强

  植物病理学报. 2022, 52(5): 791-800. https://doi.org/10.13926/j.cnki.apps.000602

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  纹枯病是水稻生产中最重要的病害之一,其病原物立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)是一种典型的土传真菌。前期我们通过立枯丝核菌侵染水稻后转录组测序,发现多个水稻内源miRNA响应R. solaniAG1-IA的侵染,其中Osa-miR535-3p的表达在R. solani侵染后被抑制。为明确Osa-miR535-3p在水稻应答R. solani侵染中的功能,本研究分别构建了Osa-miR535-3p在感病品种Xudao3背景下的敲除和过表达材料。发现与Xudao3相比,Osa-miR535-3p敲除系的纹枯病发病程度显著加重,而其过表达系的发病程度明显减轻。 Osa-miR535-3p敲除系的二级枝梗数目增多、穗长增加、分蘖数减少、千粒重增加,而其过表达系的株高降低、二级枝梗数目减少、穗长变短、分蘖数增多、千粒重下降,表明Osa-miR535-3p也参与调控水稻的农艺性状。通过RNA-seq通路分析,发现Osa-miR535-3p主要是通过影响植物激素信号通路如乙烯(Ethylene,ET)、吲哚乙酸(3-Indoleacetic acid,IAA)等信号相关基因的表达,调控水稻对纹枯病的抗性。本研究结果将为进一步解析水稻抗纹枯病分子机制提供理论参考,同时将为抗纹枯病水稻品种培育提供新思路。
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  青枯菌GMI1000效应蛋白RipQ对致病力的作用研究

  贵彩英, TAHIRA Saleem, 谢文松, 卓涛, 户勋, 邹华松, 范晓静

  植物病理学报. 2022, 52(5): 801-812. https://doi.org/10.13926/j.cnki.apps.000777

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  青枯菌通过Ⅲ型分泌系统向寄主植物细胞分泌100多种效应蛋白,对寄主植物的抗感病性产生影响。青枯菌效应蛋白RipQ启动子区存在典型的HrpB识别序列PIP box (5′-TTCGG-N15-TTCGC-3′),但其功能尚未明确。本研究分析了RipQ在青枯菌4种演化型菌株中的分布情况。以青枯菌GMI1000为出发菌,构建ripQ缺失突变体和过表达菌株,研究效应蛋白RipQ在青枯菌-番茄植物互作中的功能。结果显示,ripQ广泛分布于除演化型IV的不同青枯菌类群中。与野生型菌株相比,ripQ突变体在番茄上的致病力有一定程度的增强,而ripQ过表达菌株的致病力显著降低。突变体和过表达菌株在培养基中的生长与野生型没有区别,但过表达菌株在番茄体内的繁殖能力下降。RipQ过表达菌株侵染番茄后hrpB、hrpG和epsA基因表达量显著下调,且能够诱导番茄叶片H₂O₂的大量累积,过敏性坏死反应标志基因hin1和水杨酸信号通路标志基因PR1a的诱导表达。另外,在番茄上瞬时表达ripQ也可以观察到H₂O₂积累及叶片细胞坏死,伴随着hin1和PR1a的上调表达。这些结果表明效应蛋白RipQ具有诱导番茄抗性的作用,从而影响青枯菌在番茄植物上的致病力。
致病性与抗病性遗传
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  不同抗性黄瓜品种连作对枯萎病菌群体遗传分化的影响

  呼李乐, 黄晓庆, 卢晓红, 李世东, 罗明

  植物病理学报. 2022, 52(5): 813-820. https://doi.org/10.13926/j.cnki.apps.000775

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  尖孢镰刀菌黄瓜专化型(Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum, Foc)是引起黄瓜枯萎病的病原真菌,为了明确不同抗性黄瓜品种连作对枯萎病菌遗传分化的影响,本研究采用TEF1-α、H3基因片段对不同抗性黄瓜品种连作及对轮作后分离的枯萎病菌群体进行遗传分化分析。结果表明,感病品种连作及轮作后菌群分化程度较低( 0.007< F_ST <0.045 );与种植抗病品种一茬后的菌群相比,连作三、五茬后的菌群均发生显著分化(F_ST > 0.050),其中连作三茬后的菌群遗传分化程度最高(F_ST > 0.300)。单倍型分析发现,抗、感病品种连作后部分菌株形成新的单倍型,且分离自抗病品种的病原菌群体分化产生的单倍型数量多于感病品种。主成分分析结果进一步证明,与感病品种连作及轮作相比,抗病品种连作后病原菌菌群呈现出更显著的菌群分化。综上所述,抗病品种连作能够加剧黄瓜枯萎病菌群体的遗传分化。
植物病害及其防治
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  葡萄霜霉病对葡萄叶片代谢的影响

  何涛, 陈吉越, 孙家秀, 杨敏, 朱书生, 何霞红, 朱有勇, 杜飞

  植物病理学报. 2022, 52(5): 821-828. https://doi.org/10.13926/j.cnki.apps.000773

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  葡萄霜霉病是一种世界性病害,对葡萄生产影响极大,是葡萄栽培中主要病害之一。基于非靶向代谢组学研究技术,分析鉴定对照组与霜霉病组代谢物含量的变化,采用正交偏最小二乘判别分析并结合t检验的结果,筛选出造成健康和发病的葡萄叶片显著差异的20种主要代谢物质。其中,霜霉病处理组差异代谢物含量显著上升(P＜0.05)的物质主要分为4类:氨基酸类、核酸代谢类、植物激素类和其他化合物;显著下降(P＜0.05)的物质分6类:糖类、羧酸类、甾类、二萜醇类、三萜类和其他化合物。KEGG通路富集分析发现差异代谢物主要富集在氨酰tRNA生物合成,ABC转运蛋白,戊糖磷酸途径,二苯乙烯类、二芳基庚烷类和姜辣素生物合成,缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成和植物激素信号转导6条代谢通路中。由此可知,葡萄霜霉病侵染导致了葡萄叶片糖、核酸、氨基酸等相关代谢物的显著变化,相关代谢途径可能是霜霉菌侵染葡萄的主要机制。
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  空气湿度对灰霉菌侵染番茄叶片组织结构分析及抗氧化系统的影响

  周洁, 李甜竹, 袁泽南, 张俊威, 向凌潇, 李建明

  植物病理学报. 2022, 52(5): 829-840. https://doi.org/10.13926/j.cnki.apps.000599

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  空气湿度对番茄灰霉病的发生有显著性影响。为了探明空气湿度对灰霉菌侵染番茄叶片的过程与机理,本研究以‘金棚14-6’番茄为材料,观察分析了高空气相对湿度(80%~95%)和低空气相对湿度(65%~80%)对灰霉菌侵染番茄叶片表型变化、细胞学差异、形态结构变化、活性氧含量和抗氧化酶的影响。结果表明:高湿接种60 h大量芽管伸长出现在叶片下表皮细胞并分化菌丝,叶肉细胞间隙分布了大量的菌丝并伴随病斑出现,灰霉菌在60 h完成侵染;低湿接种108 h芽管伸长出现在叶片下表皮并分化菌丝,叶肉细胞间隙有少量菌丝分布,没有明显病斑出现。随着灰霉菌的侵染,低湿与高湿相比栅栏组织和海绵组织结构从整齐紧密变为排列疏松的时间滞后;高湿和低湿处理的叶片厚度、栅栏组织和海绵组织厚度均呈先上升后下降的变化趋势,侵染后期低湿处理的叶片组织结构厚度显著高于高湿。随着接菌时间延长,高湿和低湿的活性氧含量和抗氧化酶活性处于相对活跃的调整、适应的变化过程,大致呈先上升后下降趋势,而对照和接菌相比无显著差异,变化趋势维持在基本的振幅上。研究显示灰霉菌发生的环境条件:湿度80%~95%和侵染完成时间60 h,即控制高空气湿度的持续时间在60 h内。这为设施内番茄灰霉病的湿度调控防治提供了理论基础。
实验方法
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  基于流式细胞术的黄瓜霜霉病菌孢子囊计数研究

  任爱新, 陈思铭, 刘凯歌, 赵靖暄, 杨信廷, 李明

  植物病理学报. 2022, 52(5): 841-848. https://doi.org/10.13926/j.cnki.apps.000776

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  为病原菌时空流行动态监测及病害预测模型构建提供病原菌快速计数方法,以卵菌中代表——葫芦科霜霉病病原菌古巴假霜霉菌(Pseudoperonospora cubensis)为例,研究了孢子囊悬浮液的荧光染色方法和基于流式细胞术计数方法。研究表明EDTA和SYBR Green Ⅰ 的联合作用能够对孢子囊进行荧光标记。对SYBR Green Ⅰ 染色剂的最佳染色条件进行研究,结果表明在染色时间相同时,荧光染色剂浓度越高,染色效果越好;同一浓度荧光染色剂,随着染色时间的增加,孢子囊染色率增加。使用流式细胞术对荧光染色的孢子囊进行计数,并与显微镜血球计数板计数结果进行比较,结果显示:流式细胞仪计数结果与显微镜血球计数板计数结果得到的孢子囊浓度没有显著差异(P<0.01),对两种方法获得的孢子囊浓度取对数后进行相关性分析,显示流式细胞仪测定的孢子囊浓度与显微镜血球计数板计数得到的孢子囊浓度高度相关,相关系数为 0.993 4,表明流式细胞术可以应用于古巴假霜霉菌孢子囊的计数。
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  橡胶树胶孢炭疽菌复合群LAMP检测方法的建立及应用

  连文旭, 王萌, 张宇, 梁晓宇

  植物病理学报. 2022, 52(5): 849-856. https://doi.org/10.13926/j.cnki.apps.000780

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  由胶孢炭疽菌复合群(Colletotrichum gloeosporioides species complex)引起的炭疽病是我国橡胶树的主要病害之一。本研究以β-tubulin基因为靶标基因,设计橡胶树胶孢炭疽菌复合群特异性引物,以SYBR Green I为指示剂,建立了特异性强、灵敏度高的环介导等温扩增(LAMP)检测方法,进行了室内侵染和田间自然发病样品的检测验证。结果表明,该方法能在63 ℃恒温条件下60 min内检测出病原菌,且能特异性识别我国主要植胶区的橡胶树胶孢炭疽菌。该方法最低检测限为1 pg DNA或100个分生孢子。室内和田间样品检测结果表明,该方法可同时检测出潜伏侵染期和发病期的胶孢炭疽菌。本研究建立的LAMP检测方法为橡胶树胶孢炭疽菌的快速鉴定提供了新技术。
研究简报
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  茭白叶黑斑病的病原鉴定和防治药剂筛选

  彭辉, 杨梦飞, 葛鑫涛, 汤近天, 叶子弘, 李怡鹏, 张尚法, 贾芬花, 张雅芬

  植物病理学报. 2022, 52(5): 857-862. https://doi.org/10.13926/j.cnki.apps.001001

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  珍珠李枝枯病病原鉴定及致病性测定

  黄荣, 唐利华, 郭堂勋, 李其利, 孙文秀, 黄穗萍, 陈小林, 莫贱友

  植物病理学报. 2022, 52(5): 863-866. https://doi.org/10.13926/j.cnki.apps.000499

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  苹果茎痘病毒RdRp基因分子变异分析

  马小方, 洪霓, 蒋迎春, 吴黎明, 宋放, 何利刚, 王策, 于婷婷, 王志静, 王国平

  植物病理学报. 2022, 52(5): 867-870. https://doi.org/10.13926/j.cnki.apps.000600

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