凋萎病是近年来危害杨梅的主要病害。为了快速灵敏的检测杨梅凋萎病菌(Pestalotiopsis versicolor和P. microspora),本研究开发了常规PCR和SYBR Green实时荧光定量PCR技术各一套。利用P. versicolor (JN861773)和 P. microspora(JN861776)的ITS1-5.8S rDNA-ITS2序列的相同部分设计引物对(Pvm1L/Pvm1R)。该引物对利用常规PCR技术能特异性扩增出杨梅凋萎病菌188 bp的目标产物,而对照菌株则呈阴性。该常规PCR体系能够检测人工接种后21 d和田间自然发病的有病症杨梅组织中的凋萎病菌,检测下限是0.6×10⁵拷贝数。利用Pvm1L/Pvm1R进行SYBR Green实时荧光定量PCR,检测灵敏度是常规PCR的100倍,检测下限是0.6×10³拷贝数,能够检测出人工接种及田间已经感染但尚未表现症状的杨梅组织中的凋萎病菌。这两项技术,简单、快速、灵敏,特异性强,可以应用于杨梅凋萎病的诊断和苗木检疫。

柑橘叶斑驳病毒(Citrus leaf blotch virus,CLBV)为柑橘病毒属(Citrivirus)代表种。本研究采用RT-PCR技术从我国栽培猕猴桃上首次检测到CLBV,总检出率为13.3%。测定了5个CLBV分离物的外壳蛋白基因(coat protein gene,cp)序列,全长均为1 092 核苷酸(nt),分离物间cp基因核苷酸和编码氨基酸序列相似性分别为83.2%~99.7%和91.9%~98.9%,这些分离物与新西兰报道的CLBV猕猴桃分离物M3-A核苷酸序列相似性仅为83%左右,与来源于柑橘及近缘种的CLBV分离物cp基因核苷酸序列相似性为84%~86%。在基于该病毒cp基因核苷酸序列的系统进化树中,本研究所测定的CLBV猕猴桃分离物与新西兰报道的除M3-A外的猕猴桃分离物聚在同一组群。研究结果为进一步明确CLBV在我国猕猴桃上的侵染和危害特点及建立该病毒的分子检测技术提供了重要信息。

稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)引起的稻瘟病是水稻上的一种毁灭性真菌病害,每年导致的稻谷产量损失可养活6千万人口。从分子水平了解该病菌的致病机理,对新型药剂靶标的挖掘和病害防控策略的制定具有重要的理论和实践指导意义。生物体存在两类GTP结合蛋白,一类是异三聚体G蛋白,另一类是小G蛋白。小G蛋白分子量为20~30 KD,具有GTP酶活性,在多种细胞反应中具有分子开关作用。小G蛋白结合GTP时被激活,可作用于下游分子使之活化。当GTP水解成为GDP时,则恢复为非活化状态。细胞中存在一些专门控制小G蛋白活性的调节因子,如鸟嘌呤核苷酸交换因子(guanine nucleotide exchange factor,GEF)和GTP酶激活蛋白(GTPase activating protein, GAP)。GEF能够催化GTP的转换,而GAP的作用是加速GTP的水解,使小G蛋白向失活的状态转变。本研究在稻瘟病菌中鉴定到一个GAP蛋白MoGcs1,并对该蛋白编码基因的生物学功能进行了研究。对MoGCS1基因进行敲除突变发现,ΔMogcs1突变体产孢量显著下降,分生孢子形态异常,且附着胞形成加快,但突变体的营养生长和致病能力与野生型比较无明显变化。进一步研究发现,突变体对外界盐胁迫敏感性升高,对细胞壁胁迫敏感性降低。上述结果表明,MoGcs1是稻瘟病菌生长发育过程中一个重要的蛋白,参与调控病菌的无性繁殖、附着胞分化及对外界胁迫的应答。

通过反向遗传学方法和半定量RT-PCR方法,研究了十字花科黑腐病菌中被注释的应急反应相关基因spoT_Xcc与III型分泌系统(T3SS)基因的调控关系。基于自杀质粒pK18mob 同源整合方法构建了十字花科黑腐病菌spoT_Xcc基因(XC_0956)的非极性整合突变体,检测了突变体的多种表型,发现spoT_Xcc突变体延迟了在非寄主植物辣椒ECW-10R上引发的过敏反应(HR)。利用GUS(β-葡糖苷酸酶)活性检测、原位组织染色和半定量RT-PCR的方法,发现T3SS相关基因在spoT_Xcc基因的非极性整合突变体中表达量降低,表明十字花科黑腐病菌中被注释的应急反应相关基因spoT_Xcc显著正调控T3SS相关基因的表达。

γ-变形菌纲(γ-Proteobacteria)的黄单胞菌属(Xanthomonas)的大多数种类可引起植物病害,多数是我国检疫对象。与其他革兰氏阴性植物病原细菌一样,植物病原黄单胞菌可通过高度保守的III型分泌系统(type-III secretion system, T3SS)分泌效应蛋白(T3SS-secreted effectors, T3SEs)进入植物细胞,在非寄主植物和抗病寄主植物上产生过敏反应(hypersensitive response, HR)以及在感病寄主植物上具有致病性。尚不清楚哪些种类的黄单胞菌具有T3SS和缺少哪些T3SE是否可作为检疫的依据。搜集7种检疫性植物病原黄单胞菌,通过PCR和Southern杂交试验结果发现:香蕉细菌性青枯病菌(X. campestris pv. musacearum)的ICMP287和ATCC49084菌株、甘蔗流胶病菌(X. axonopodis pv. vasculorum)ATCC13901菌株、洋葱细菌性叶枯病菌(X. axonopodis pv. allii)的LMG576和LMG578菌株中不含有tale基因,并且ATCC13901菌株既不含有T3SS基因也不含有hpa1和xopQ基因;菜豆细菌性疫病菌(X. campestris pv. phaseoli)ATCC49119菌株不含有hpa1基因。相应地,推测含有2~12个tale基因的黄单胞菌有:大豆斑疹病菌(X. axonopodis pv. glycines)ICMP5732和ATCC43911菌株、豌豆细菌性疫病菌(X. axonopodis pv. vignicola)ATCC11648菌株、棉花细菌性角斑病菌(X. campestris pv. malvacearum)ATCC12131和(X. campestris pv. phaseoli)ATCC49119菌株。大豆细菌性斑疹病菌ATCC43911菌株尽管含有hpa1、xopQ和hrcC基因,但在非寄主烟草上不能激发HR反应;而甘蔗流胶病菌ATCC13901菌株不含有hpa1、xopQ和hrcC基因,却激发烟草产生HR反应。这些结果对于分析比较不同植物病原黄单胞菌的致病性因子和设计特定的植物检疫靶点提供了科学线索。

为探明3,4,5-三羟基苯甲酸甲酯(MG)抑制茄青枯拉尔氏菌的机制,利用二维电泳技术,分析了MG作用下茄青枯拉尔氏菌Rs-T02菌株的差异蛋白。结果发现,在MG作用下的菌体中检测出29个差异蛋白点。采用质谱技术鉴定出22个差异蛋白,其中新增蛋白11种、缺失蛋白5种、表达上调蛋白1种和表达下降蛋白5种。这些蛋白参与能量代谢、信号转导、物质运输和DNA修复等途径。我们推测,与能量代谢相关的新增蛋白spot 9和缺失蛋白spot 65可能与MG抑制茄青枯拉尔氏菌的机制有关。

MicroRNA作为一种内源小分子非编码RNA,在植物生长发育、信号转导、转录调控、新陈代谢及各种胁迫条件下发挥重要作用。本研究通过生物信息学技术对黄瓜miR159和miR858的靶基因进行预测和功能分析,结果显示miR159和miR858的靶基因主要为MYB类转录因子家族成员,参与植物生长发育和抗病过程。实时荧光定量PCR分析黄瓜绿斑驳花叶病毒(CGMMV)不同侵染时期在黄瓜不同组织中目的miRNA的表达特征,结果表明黄瓜miR159和miR858的表达具有时空特异性和组织特异性,二者均可对CGMMV侵染做出响应并存在显著差异表达。

PCR扩增烟草丛顶病毒(Tobacco bushy top virus,TBTV)的ORF1序列并克隆到原核表达载体pEHISTEV中,转化大肠杆菌Rosetta菌株经IPTG诱导表达TBTV ORF1蛋白。利用切胶纯化的ORF1蛋白免疫新西兰大耳白兔制备并获得抗血清,间接ELISA检测效价为1∶24 3000。经抗原亲和纯化从抗血清中得到特异性和灵敏度俱佳的ORF1多克隆抗体。 Western blot分析显示,TBTV ORF1多克隆抗体既可以检测田间发病的烟草丛顶病样品中ORF1 蛋白,也可检测在体内和体外翻译体系中的TBTV ORF1蛋白的表达。另外,发现ORF2 蛋白以ORF1延长蛋白的形式存在,根据ORF1和 ORF2的重叠情况及潜在的七核苷酸滑动序列和下游的稳定二级结构,推测此ORF1延长蛋白是移码翻译产物。

为进一步筛选高效寄生线虫真菌和阐明其寄生线虫卵的机理,本研究从湖北省烟草南方根结线虫雌虫分离到1株具高效生防潜力的菌株HBF1。形态学、rDNA-ITS和翻译延长因子tef1-α序列分析鉴定该菌为长梗木霉菌Trichoderma longibrachiatum,其对南方根结线虫卵第10 d寄生率为80.45%。通过简并引物设计和RACE技术克隆其几丁质酶基因,分析该基因序列及与其他几丁质酶的同源性。该菌是1株可以产生几丁质酶的南方根结线虫卵寄生真菌,第10 d几丁质酶的活性达到高峰,为24.88 μmol/h/mL。本研究首次从长梗木霉HBF1菌株中克隆到1个几丁质酶基因TlChi46,该基因DNA全长1 793 bp,含3个内含子和1个1 272 bp的开放阅读框,编码423个氨基酸,理论分子量45.9 kDa,等电点5.23。同源性比对表明和昆虫寄生菌几丁质酶的亲缘关系较远。从长梗木霉HBF1中克隆得到的几丁质酶基因编码的几丁质酶的功能域可供进一步研究,高效产几丁质酶并有效寄生南方根结线虫卵的长梗木霉对南方根结线虫具有良好的生防潜力。

利用四倍体马铃薯栽培种‘大西洋’和‘陇薯6号’杂交得到的190个F₁株系为作图群体,构建了四倍体马铃薯的分子遗传图谱,采用区间作图法对马铃薯晚疫病抗性进行了QTL初步定位。结果显示:通过对190个F₁株系进行检测,共发现有7个与晚疫病抗性相关的QTL位点,分别分布在第5、6、7、10和11连锁群上;各位点的LOD值在2.70～10.32之间,其中主效QTL位点3个(LOD≥3.5),可解释17.37%～65.68%的表型变异。获得紧密连锁的特异标记(S183-210、S148-460)为进一步进行QTL精确定位提供了参考。

选用16对毒性相关基因特异性引物对四川和重庆9个县(市)分离到的200个稻瘟病菌单孢菌株进行PCR扩增,并采用最长距离法进行聚类分析,结果显示各引物均能扩增出其目的条带,多态位点百分率(P)高达93.75%,扩增频率差异较大;200个菌株可归为70个不同的单元型,其中单元型SCH13为优势单元型;在0.86遗传相似水平上,200个菌株可划分为27个遗传宗谱,包括1个优势宗谱,3个亚优势宗谱,14个次要宗谱,9个小宗谱,层次丰富;在群体平均水平上,病菌群体具有丰富的遗传多样性(H=0.324 4,I=0.484 2),且群体间差异较大;9个种群在遗传距离为0.05水平上可分为4个类群,种群遗传谱系与地理区域分布呈一定相关性。同时,该地区的群体存在一定的遗传分化(HT=0.320 0),群体内多样性大于群体间多样性(Hs=0.179 6,Dst=0.140 4),总遗传变异的56.13%存在于群体内(Gst=0.438 7),群体间基因流动性较小(Nm=0.639 6)。本研究揭示了四川和重庆部分区域稻瘟病菌群体遗传结构、遗传多样性及其与地理分布之间的关系,为抗病育种和品种布局奠定了基础。

西藏自治区是我国小麦条锈病发生与流行相对独立的一个区系,小麦条锈病是严重影响西藏小麦安全生产的重要病害之一,林芝地区是西藏自治区小麦条锈病重要的常发区和流行区。已有研究证实,小檗是小麦条锈菌的转主寄主之一,并在我国小麦条锈菌致病性变异产生新菌系和小麦条锈病的发生过程中起作用。林芝地区小檗种类较多,但目前对林芝地区小檗是否能作为小麦条锈菌的转主寄主缺乏相关的研究和报道。本文针对小麦条锈病常发区的西藏林芝地区小檗资源进行了调查,对小檗能否作为小麦条锈菌转主寄主进行了鉴定。结果表明6种小檗在林芝地区常见且分布广泛,均是小麦条锈菌的转主寄主。这对进一步研究西藏小麦条锈病的发生、流行与病原菌致变性变异起着重要作用。

2012和2013两年度采用Burkard定容式孢子捕捉器,对田间空气中小麦白粉病菌分生孢子的监测结果表明,小麦冠层内、外白粉菌分生孢子浓度存在显著的正相关性,冠层内的白粉菌分生孢子浓度明显高于冠层外;田间空气中分生孢子的浓度逐渐升高,到小麦灌浆期达到最大值,之后逐渐降低。时间序列分析结果表明,两年度田间空气中白粉菌分生孢子浓度均符合ARIMA(1,1,0)模型,且与温度有显著的相关性,建立了基于温度的白粉菌分生孢子浓度预测模型,模型回归效果均达到了显著水平。研究结果发现,田间白粉病病情与空气中病菌分生孢子和关键气象因子具有显著相关性,并在此基础上分别建立了基于空气中分生孢子浓度,以及基于分生孢子浓度和气象因子的田间白粉病病情预测模型,其中基于分生孢子浓度的预测模型普适性要优于基于分生孢子浓度和气象因子的预测模型,可以用来预测田间小麦白粉病的发生流行程度。

在广西香蕉种植区发现一种引起香蕉黑斑病的新病原。通过对病原菌分离培养、致病性测定、形态学观察、分子生物学鉴定及对该病原菌生物学特性进行初步研究，表明引起该病害的病原菌为芒果球座菌(Guignardia mangiferae A.J. Roy)。该病原菌菌落为深橄榄色，产生棒状子囊、梭形子囊孢子及倒梨形分生孢子；其最适生长温度为28℃，最适pH 值为6；病原菌生长较好的碳源为果糖和阿拉伯糖，氮源为蛋白胨和酵母膏；在全光条件下，病原菌菌丝扩展速度最快；菌丝的致死温度为54℃。由G. mangiferae引起的香蕉黑斑病，在国内外为首次报道。

由灰葡萄孢(Botrytis cinerea Pers.)引起的草莓灰霉病是严重危害草莓的病害之一。为了解草莓灰霉病菌对杀菌剂嘧菌酯的抗性情况,本研究针对2012年从国内10省市采集和分离的134株草莓灰霉病菌菌株,利用特异性引物BcAR-F/BcAR-R扩增其cytb基因的部分序列,进行了嘧菌酯抗性的分子检测;对检测出的抗性菌株在嘧菌酯浓度分别为22.4、112和224 μg·mL^-1的含药培养基上进行抗性验证;此外,还比较了抗性菌株与敏感菌株主要生物学性状的差异。结果表明,有54个菌株对嘧菌酯表现抗性,均属于中等抗性水平,占检测总数的40.3%,分布于北京市、湖北、江苏、河北、辽宁和四川各省;对15个抗性菌株cytb基因的序列分析表明,其第143位发生突变,由甘氨酸变为丙氨酸;对随机选取的4株抗性菌株和2株敏感菌株的适合度测定结果发现,抗性菌株和敏感菌株在最适生长温度、菌落生长速度、孢子萌发率方面没有表现出规律性差异,但抗性菌株的产孢量和致病力均显著低于敏感菌株。

In 2014, a disease of black spot was found on leaves of Avicennia marina (one of the mangroves) in Donghai island of Zhanjiang, Guangdong Province. By the method of pathogen-containing tissue isolation and pathogenicity test, we obtained a pathogenic isolate bgr1. Based on morphological characteristics and sequence analysis of rDNA-ITS and glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (gpd) gene, the isolate was identified as Stemphylium lycopersici. This is the first report of leaf black spot on Avicennia marina in China.

Tar spot of Dalbergia odorifera, caused by Phyllachora dalbergiicola, is a common disease, and seriously affected the rate of photosynthesis. Here we developed a species-specific Nested-PCR approach for rapid and accurate detection of P. dalbergiicola, based on the differences in internal transcribed spacer (ITS) sequences of P. dalbergiicola and another P. spp., an endophytic fungus, from which a pair of species-specific primers P1/P2(P1:5'-CGAGGTCAGAATCAAACG-3', P2:5'-TGAAGAACGCAGCGAAAT-3'), was designed. P1/P2 amplified only a unique 273 bp band from the genomic DNA of P. dalbergiicola. A Nested-PCR procedure using ITS4/ITS5 as the first-round primers, followed by P1/P2 primers, increased detection sensitivity 10 000 fold to 100 ag. Using the Fast DNA-kit to extract DNA from the diseased plant tissues, the detection of the pathogen by Nested-PCR assay could be completed within 1 day. The results suggested that the PCR-based methods here could simplify both plant disease diagnosis and pathogen detection

Toxin-producing culture medium and culture time for Phomopsis asparagi were optimized, and the effect of the pathogen toxin on asparagus callus was investigated in the study. It was found that the toxin produced from culture for 12 days in the Fries medium showed the strongest inhibition effect on asparagus radicle. Toxin caused callus of ‘Apollo’, ‘Champion’ and ‘NJ987’ browning. Resistance of the callus of the three varieties to toxin could be induced by toxin treatment. Toxin concentration for resistant callus selection was 30%-40%.

水稻稻曲病(rice false smut)近年来在我国长江中下游地区和东北地区发生趋于严重,已经上升为水稻生产的主要病害之一,但是关于该病害的侵染方式尚存在争议。本研究以稻曲病菌线粒体核酸序列为检测靶标,建立了一套更加简便快速的PCR检测体系,并通过该检测体系对常发病田内30 d秧龄移栽后35 d的苗期水稻植株以及灌浆期发病植株体内稻曲菌的分布情况进行了检测。研究结果表明,所建立的检测体系具有较好的特异性,灵敏度可达到1 pg水平。对移栽后35 d的苗期样品和灌浆期病株不同组织进行检测发现,在苗期水稻的根和叶鞘组织以及灌浆期发病植株的茎组织中,均可检测到稻曲菌。该结果为稻曲病菌在水稻不同发育时期、不同组织内的分布情况提供了直接的分子证据,并为稻曲病侵染过程的进一步研究以及大田防治策略的制定奠定了基础。

真菌病毒在真菌中广泛存在,一些真菌病毒可以影响病原真菌营养生长、产孢和色素形成等性状。本文研究了真菌病毒在水稻稻瘟菌中的多样性以及其对寄主生物学性状的影响。采用单孢分离的方法从发病水稻叶片上分离获得了120个稻瘟菌菌株,其中约52%携带dsRNA片段。菌株QSP5被2个基因组为dsRNA的病毒即产黄青霉病毒1-C(Magnaporthe oryzae chrysovirus 1-C, MoCV1-C)和稻瘟菌病毒3(M. oryzae virus 3, MoV3)所侵染。对菌株QSP5进行单个的分生孢子纯化,获得了仅携带MoV3的菌株QSP5-9。菌株QSP5与QSP5-9的产孢量、菌丝形态以及菌落形态存在明显差异,经研究推测MoCV1-C与菌株QSP5 的产孢能力衰退、菌丝生长和产色素异常相关。同时对MoV3的稳定性进行了初步的研究。从稻瘟菌菌株QSP5获得了100个单孢分离物,通过对随机挑选的40个单孢分离物进行检测,结果表明这些分离物100%携带MoV3,只有部分单孢分离物携带MoCV1-C。另外,从稻瘟菌菌株QSP5-9获得了94个单孢分离物,对随机挑选的45个单孢分离物进行检测,结果表明这些分离物中均含有与菌株QSP5-9大小相同的dsRNA片段。根据以上结果推定MoV3在稻瘟菌菌株QSP5和QSP5-9及其无性后代中具有一定的稳定性。

疫霉菌分泌的RxLR效应子能干扰寄主植物细胞的正常生理代谢和功能。我们通过同源序列搜索在辣椒疫霉菌中鉴定到9个PiAvr3a的同源基因(PiAvr3a-like),同时发现PiAvr3a-like在大豆疫霉菌中也有分布,表明该类基因可能在疫霉菌致病过程中发挥重要作用。从辣椒疫霉菌中成功克隆了5个PiAvr3a-like基因,表达模式分析发现PcAvh128/132/134这3个基因在疫霉菌侵染早期诱导表达,暗示它们可能在侵染前期发挥功能。接种实验表明在本氏烟中瞬时表达其中的PcAvh128可以显著促进辣椒疫霉菌的侵染,而PcAvh132活性相反,其他3个基因没有明显活性。这5个基因均不能抑制INF1和效应因子诱导的细胞死亡,也不能诱导可见的过敏反应。上述结果表明PiAvr3a-like基因不同成员之间功能存在分化,这为疫霉菌和寄主的分子互作研究提供了材料和参考。

利用MT选择性培养基从进境加拿大豌豆样品上分离到一株细菌分离物(编号1314),对该分离物进行PCR检测、16S和23S rRNA序列扩增、多位点序列分析、Biolog测定、烟草过敏性反应和致病性测试。豌豆细菌性疫病菌(Pseudomonas syringae pv. pisi, Ppi)特异引物AN7F/AN7R扩增分离物1314和Ppi菌株ATCC 11043得到预期272 bp的条带,二者的PCR产物序列一致,与GenBank中Ppi (X97405)的序列相似性为99.57%。分离物1314的部分16S rRNA、23S rRNA序列以及16S-23S序列均与Ppi菌株ATCC 11043一致。选择gap1、gltA、gyrB和ropD 4个看家基因进行多位点序列分析,系统发育树显示分离物1314与Ppi菌株聚在同一组内。Biolog鉴定结果表明:分离物1314为Ppi,PROB值为0.898,SIM为0.72。该分离物人工接种豌豆茎秆能引起水渍状症斑,接种烟草叶片产生过敏性反应。基于上述试验结果,将分离物1314鉴定为豌豆细菌性疫病菌。

为了明确棉花库源比(铃叶比)变化对红叶茎枯病发生的影响,揭示红叶茎枯病的病因,本研究开展了多项试验。试验结果显示,棉株的病害严重度与其铃叶比呈高度正相关。早熟品种开花期早,铃叶比高,病害发生重;盛蕾期以前的气温对棉花生长和红叶茎枯病发生的作用大于土壤水分的作用。与常温处理相比,提高棉花3叶期至盛蕾期的气温,可促进棉花的营养生长,减小库源比,其发病盛期延后约45 d,病情指数平均减少72.9%,棉花生物学产量平均提高123.8%;去蕾和推迟打顶均可降低棉花铃叶比,减轻病情,以去全蕾处理的作用最为明显;叶面喷施甲哌鎓可提高棉花铃叶比,利于病害发生。因此,铃叶比失调是红叶茎枯病的主要病因;开花期以前棉花代谢源(叶)的生长量决定着病害发生的时间和严重度。

本文探讨了不同浓度茉莉酸甲酯(MeJA)对小麦抗病性的诱导作用,同时电镜观察了不同浓度MeJA对小麦条锈菌(Puccinia striiformis f.sp. tritici)与寄主细胞超微结构的影响。结果表明,2.00 mmol·L^-1 MeJA对小麦条锈病的诱导抗性效果最好,可达到35.87%,而0.50 mmol·L^-1 MeJA在小麦条锈菌夏孢子开始萌发4 h时呈显著抑制作用。经外源MeJA处理后,条锈菌的胞间菌丝、吸器母细胞和吸器的发育明显受到抑制,其中侵染位点的叶肉细胞呈抗性症状。因此,MeJA可使小麦幼苗产生诱导抗性从而提高其抗病性。

瓜类细菌性果斑病是葫芦科作物上的一种严重的世界性病害,其病原菌为西瓜嗜酸菌 (Acidovorax citrulli)。本研究以野生型菌株Ac-5为研究对象,通过同源重组双交换的方法,构建了LuxR 家族功能基因luxR₄₂₂₉的全基因缺失突变株,并对突变株进行致病性、生物膜形成能力和运动能力等生物学特性测定。同时,qRT-PCR 定量检测了鞭毛基因fliR 和fliC以及 III 型分泌系统功能基因hrpE 和 hrcN 的表达水平。结果显示:与野生型相比,突变株致病力明显降低,运动能力减弱,而生物膜形成能力增强。fliR、fliC、hrpE 和hrcN基因在突变株中的表达量下调,luxR₄₂₂₉对fliR、fliC、hrpE 和hrcN基因均为正调控。基因luxR₄₂₂₉在对西瓜嗜酸菌致病力、运动能力及生物膜的形成具有重要调控作用。

AvrXccC是野油菜黄单胞菌Xcc8004的一个III型分泌效应蛋白。前期研究发现AvrXccC在拟南芥rar1突变体上发挥毒性功能,并且抑制植物的先天免疫反应。但是,AvrXccC在植物体内的毒性靶标还不清楚。本研究发现AvrXccC与植物体内的蛋白激酶BIK1发生特异的相互作用。然而,在拟南芥原生质体中,AvrXccC 并不能抑制鞭毛蛋白诱导的BIK1迁移,表明AvrXccC不是通过抑制BIK1的磷酸化来发挥功能的。有趣的是,AvrXccC可以在体外直接被BIK1磷酸化,我们推测AvrXccC可能作为BIK1的底物从而干扰了鞭毛蛋白诱导的先天免疫反应。

疫霉是世界关注的一类植物病原真菌。以疫霉属80个种122个菌株为研究材料,以ITS、CO1、EF-1α和β-tubulin 4个基因片段为候选DNA条形码,分析表明ITS、CO1基因的PCR扩增和测序成功率最高,分别为100%和96.7%;ITS、CO1和β-tubulin存在明显的条码间隔,但种间、种内距离频率分布存在较小重叠;种间、种内遗传距离Wilcoxon秩和检验结果认为各基因对种内遗传距离的效力相等,对种间遗传距离的区分能力为ITS>CO1>β-tubulin。CO1基因和ITS片段可同时作为11种检疫性疫霉的首选DNA条形码,β-tubulin基因可作为辅助DNA条形码。

稻瘟病是严重危害水稻生长的真菌病害,每年给水稻生产带来重大经济损失。与野生型日本晴NPB相比,OsDCL1基因沉默突变体增强了水稻对稻瘟菌的广谱抗病性。为了解水稻OsDCL1-RNAi突变体的抗病机制,我们分析和比较了它和野生型日本晴NPB在稻瘟菌侵染前后转录组水平的变化。响应稻瘟菌侵染的7 129个差异表达基因(DEGs)中,NPB和OsDCL1-RNAi突变体分别有5 382和5 180个基因表达发生了变化,参与生物胁迫反应、信号通路、蛋白代谢和RNA调控4个通路的基因明显被富集。以野生型未受稻瘟菌侵染的基因表达为对照,在OsDCL1-RNAi突变体中共发现1 318个DEGs,且超过70%是上调的,其中很多基因参与了生物胁迫反应(26.9%)和信号通路(11%),上调表达基因中与生物胁迫反应相关的主要为PR基因和细胞壁相关基因。另外,还发现10个茉莉酸相关基因和11个水杨酸相关基因分别在OsDCL1-RNAi突变体中显著下调和上调表达。在OsDCL1-RNAi突变体中还发现WRKY和MYB等一些转录因子家族以及部分受体类激酶被诱导表达。用qRT-PCR方法验证部分差异表达的基因,其结果与DEGs基本一致。OsDCL1-RNAi突变体中转录组变化的分析,为深入了解该突变体抗瘟性增强的机制奠定了基础。

利用草莓镶脉病毒(Strawberry vein banding virus, SVBV)全长克隆pSVBV-E3构建SVBV侵染性克隆。pSVBV-E3经限制性内切酶酶切分别获得0.5-mer SVBV和1.0-mer SVBV,依次正向插入植物表达载体pBINPLUS,成功构建侵染性克隆重组质粒pBIN-1.5SVBV。pBIN-1.5SVBV转化农杆菌,分别接种森林草莓(Fragaria vesca)和4种烟草属植物(Nico-tiana spp.)验证其侵染性。结果表明,SVBV侵染性克隆接种森林草莓8周后发病,表现出典型的叶脉镶边黄化症状,PCR法可以从显症森林草莓中检测出SVBV cp基因,Southern blot法可以检测出SVBV基因组。而接种4种烟草属植物8周后未观察到发病症状,PCR法也未检测出SVBV cp基因。构建的SVBV侵染性克隆经接种验证能够侵染森林草莓,为进一步研究SVBV侵染森林草莓的致病机制奠定了基础。

烟草丛顶病主要由烟草丛顶病毒(Tobacco bushy top virus ,TBTV)和烟草扭脉病毒(Tobacco vein distorting virus ,TVDV)复合侵染引起。其中,TVDV的CP蛋白可分别包装TBTV和TVDV形成病毒粒子;但也存在TVDV单独侵染不携带TBTV的病样。本文利用RT-PCR对自然状态下携带TBTV的TVDV(采自云南弥渡)和不携带TBTV的TVDV (采自云南保山)的cp基因进行序列克隆,发现TVDV弥渡分离物的cp基因为618个核苷酸,而TVDV保山分离物的cp基因为621个核苷酸,二者的核苷酸序列一致性为90.02 %,氨基酸序列一致性为89.81 %;而长度相同的TVDV cp基因序列一致性为98.5 % ~ 100 %。表明这2个cp基因属于2种不同类型。系统发育树分析也表明这2个cp基因属于进化距离较远的2个群。利用SWISS-MODEL进行同源建模,发现2种类型的TVDV CP蛋白的主要空间结构域基本一致,存在细小的结构域及结构域之间无规则卷曲角度的差异,整体空间结构没有发生明显改变。推断TVDV保山分离物CP蛋白中关键氨基酸的序列突变是导致CP无法包装TBTV,从而在病害传播过程中丢失TBTV的主要因素。

稻曲病近年来逐步上升为世界多个水稻产区的主要病害之一。利用丰富的抗性种质资源进行抗性品种选育是控制稻曲病害的重要手段。通过在四川省进行三年病圃筛选试验,我们从843份水稻材料中鉴定出179份完全不感稻曲病的抗性材料和两份高感材料(病穗率高达50%以上),其余材料的病穗率介于0.1%~48.8%之间,55.1%的病穗只有一个稻曲球,而高感稻曲病的蒲江6号单穗稻曲球高达38粒。然后我们选取36份材料进行多点多期播种,进一步验证其稻曲病抗感性。结果表明,有3份材料在所有试验中都不感稻曲病,18份材料偶发稻曲病呈现高抗,蒲江6号仍然表现为高感。我们用450对SSR引物对其中35份材料与蒲江6号进行多态性分析,发现其中12份材料与蒲江6号的多态性达10%以上,其中最高为ITAT144(16.1%),其次是泸香90-2(14.8%)和Domsia-2(14.4%)。因此,我们选择这些材料与蒲江6号杂交构建基因定位与克隆群体。

十字花科黑腐病菌(Xanthomonas campestris pv. campestris, Xcc)是全球范围内能引起十字花科植物黑腐病的重要植物病原细菌,也是研究植物病原细菌与植物互作机制的模式细菌。利用自杀质粒pK18mobsacB诱变十字花科黑腐病菌Xcc 8004的XC_3605基因,获得缺失突变体D3605。表型分析发现D3605胞外多糖合成能力、游动能力及致病力显著降低,积聚形成生物被膜的能力增强。用带有全长XC_3605基因序列的 pLAFRJ对D3605进行功能互补,其胞外多糖产量、游动性、致病力和生物被膜均得到恢复。研究结果表明,XC_3605基因在十字花科黑腐病菌致病过程中发挥作用。

通过田间小区人工接种试验,分析比较了花生褐斑病和网斑病单独及混合发生的流行过程及对花生产量损失的影响。结果表明,在病害混发初期,病害间无明显的相关性,随着病情加重,病害间的负相关性逐渐增大并达到显著水平,说明病害间有明显的抑制作用。在不同生育期接种发病情况有所差异,在开花初期和盛花期接种,褐斑病和网斑病的病情较重,而在开花末期接种的病情较轻,但都能表现病害间的抑制作用。病害混发时造成的产量损失小于各病害单独造成损失之和,对白沙1016和四粒红接种2种病菌,病害混合发生所造成产量损失约为各病害单独引起损失之和的77.2% ~ 85.7%和76.1% ~ 79.6%。在不同生育期接种2种病菌,2个品种产量的损失均随着侵染时期的推迟而逐渐降低。

通过生物学特性观察和16S rDNA基因序列分析鉴定菌株SC11为壮观链霉菌(Streptomyces spectabilis)。该菌可在棉花根际土壤以及棉花根部长期定殖,30 d的定殖密度分别为1.38×10⁵ CFU/g和2.95×10³ CFU/g。2011年和2012年的大田防治试验显示,SC11菌粉对棉花枯萎病防效分别为42.51%和36.70%,与对照50%多菌灵(WP)的防效相比无显著差异,施用90~150 d的防效分别显著高于多菌灵(P<0.05)。与清水对照相比,田间施用SC11菌粉棉花倒三叶面积显著提高52.6%,籽棉和皮棉产量分别增加21.9%和23.0%(P<0.05)。研究结果表明,壮观链霉菌SC11是一株对棉花枯萎病具有应用前景的生防菌株。

银白杨,杨属植物,广泛种植于中国东北部地区,其锈病发生特别严重。在本研究中,根据形态特征和生活史将白杨锈菌鉴定为Melampsora laricis。使用杨树锈病叶片上的担孢子对日本落叶松及白山落叶松进行接种试验,结果证实了其精子器和锈子器世代发生在落叶松植物上。

It should be taken seriously to monitor powdery mildew (PM) of wheat quickly and accurately in continuous space since the outbreak of this disease may cause substantially reduction of output and lower the quality of wheat. A new method was presented to monitor the external environment of the PM pathogen based on the remote sensing information including greenness wetness and land surface temperature (LST) and the meteorological information including temperature and the number of rainy days. Three kinds of models were established using algorithms Fisher liner discriminant analysis (FLDA) and support vector machine (SVM), respectively. And these models were individually used to supervise the incidence of PM in the western regions of Guanzhong Plain, Shaanxi Province. The results showed that the integrating models (integrating the remote sensing information and the meteorological information) reached at a satisfactory accuracy (FLDA: 74%, SVM: 77%). The integrating models performed better than the meteorological models (FLDA: 60%, SVM: 65%) and the remote sensing models (FLDA: 65%, SVM: 70%). The SVM method outperformed the FLDA method. The results indicated that the integration of remote sensing information and meteorological information can promote the monitoring accuracy of plant diseases.

由丝核菌引起的根腐病是草莓生产上的重要病害之一。本研究基于形态学、菌丝细胞核荧光染色、菌丝融合群测定、rDNA-ITS序列分析和柯赫氏法则验证,对北京地区引起草莓根腐病的丝核菌进行了鉴定。2014年从北京市昌平区温室草莓根腐病病样中分离纯化获得的3个代表菌株,经形态学和细胞核荧光染色,确定均为双核丝核菌(binucleate Rhizoctonia, BNR),且与双核丝核菌AG-A融合群菌株发生菌丝融合,菌株CP-Z的rDNA-ITS序列与GenBank中丝核菌属的有性型角担菌属(Ceratobasidium)AG-A融合群 4个菌株的相似性达100%。菌株CP-Z接种草莓根部,引起根系变黑、腐烂,植株死亡,从接种发病的根部可重新分离到双核丝核菌。双核丝核菌AG-A融合群引起草莓根腐病为国内首次报道。该病原菌菌丝生长适温为25℃~28℃。

为明确河南省小麦赤霉病种群组成和致病力分化情况,2007—2014年对河南省15个市84个田块的327个小麦赤霉病菌进行种群鉴定、毒素化学型分析和致病力分化研究,结果表明:Fusarium graminearum s. str.和F. asiaticum是河南省小麦赤霉病的优势种群(97%),F. pseudograminearum(2.1%)、F. culmorum(0.3%)、F. equiseti(0.3%)、F. verticillioids(0.3%)为次要种群;对于禾谷镰刀菌复合群来说,豫北地区分布只有F. graminearum s. str.,豫中地区F. graminearum s. str.和F. asiaticum都存在,以F. graminearum s. str.为主,豫南地区F. graminearum s. str.和F. asiaticum都存在,以F. asiaticum为主;291个F. graminearum s. str.都为15ADON类型,26个F. asiaticum菌株中22个为3ADON,1个为15ADON,3个为NIV类型;F. graminearum s. str.(15ADON)也存在致病力分化,强、中、弱致病力的菌株在河南省的比例约为2:2:1。

由植物病原细菌引起的芹菜软腐病在北京地区普遍发生,其中以顺义及通州区县较为严重。自发病芹菜茎段中分离细菌,通过接种芹菜进行致病性测定,确定了54个致病菌株。虽然菌株间致病力有一定的差异,但大多数菌株对芹菜致病力强。通过培养性状和菌体形态观察、生理生化反应和Biolog测定,结合胡萝卜软腐果胶杆菌Pectobacterium carotovorum 6个管家基因(pgi、rpoS、mdh、proA、mtlD、icdA)的基因扩增、序列测定和多基因联合系统发育分析,将病原菌鉴定为胡萝卜软腐果胶杆菌P. carotovorum的3个亚种。其中45个菌株为P. carotovorum subsp. odoriferum,频数为83.33%;6个菌株为P. carotovorum subsp. carotovorum,频数为11.11%;3个菌株为P. carotovorum subsp. brasiliensis,频数为5.56%。上述结果显示,北京地区芹菜细菌性软腐病的病原菌为胡萝卜软腐果胶杆菌P. carotovorum的3个亚种,其中以P. carotovorum subsp. odoriferum为优势种。

本研究通过对多个小麦矮缩病毒(Wheat dwarf virus, WDV)小麦分离物进行序列分析,在编码Rep蛋白N 端的基因保守区域设计一对特异性引物和一条长度为19 bp的TaqMan LNA探针,经过探针和引物浓度的系列优化,建立了WDV田间样品LNA探针实时荧光定量PCR检测方法,确定最优反应条件下的引物和探针终浓度分别为0.5 μmol/L和0.3 μmol/L。该方法建立的标准曲线斜率及相关系数分别为-3.424 3和0.997 3,扩增效率为96.0%,重复性试验组内变异系数为0.11%~1.34%,组间变异系数为0.44%~1.21%,最低检测限为55 copies/μL,其灵敏度是普通PCR的100倍以上。与普通TaqMan探针荧光定量PCR相比,该方法所用探针长度大大缩短,减少了探针间形成二级结构的机会,探针设计更加简单、方便。该方法适用于田间样品的早期监测,为病害流行调查提供了高效快捷的技术支撑。