由镰孢菌(Fusarium spp.)引起的小麦赤霉病在全世界均有发生,我国小麦赤霉病主要由禾谷镰孢菌复合种(Fusarium graminearum species complex, FGSC)所引起,根据产生单族毒素种类分为三种化学型,分别为3-乙酰脱氧雪腐镰孢菌烯醇(3-AcDON)、15-乙酰脱氧雪腐镰孢菌烯醇(15-AcDON)和雪腐镰孢菌烯醇(NIV)化学型。为了更方便地对禾谷镰孢菌复合种进行化学型的区分,本研究利用三对引物分别扩增了三种化学型菌株的Tri8基因并进行了序列测定,根据不同化学型菌株的基因序列差异,进行了特异性引物设计和筛选。利用设计的引物同时扩增三种化学型的Tri8基因并用AvaI内切酶进行酶切,根据酶切片段的大小区分三种化学型。研究表明该方法可准确有效地区分我国小麦赤霉病菌的化学型。

本研究对2015年收集的春玉米区玉米穗腐病样本的病原菌进行了分离鉴定。结果表明,禾谷镰孢复合种(Fusarium graminearum species complex)的总分离频率最高,为35.90%,为优势菌。进一步分析显示,山西、河北、吉林和黑龙江省以禾谷镰孢复合种为主,分离频率分别为81.25%、 75.00%、 44.00%和44.44%;内蒙古以拟轮枝镰孢菌(F. verticillioides)为主,分离频率为56.25%;辽宁省拟轮枝镰孢菌和哈茨木霉(Trichoderma harzianum)的分离频率分别为34.48%和31.03%;而在陕西省,禾谷镰孢复合种、拟轮枝镰孢菌和亚粘团镰孢菌(F. subglutinans)分离频率均为28.57%。以禾谷镰孢复合种的EF-1α基因序列为基础构建系统发生树,进一步对分离到的禾谷镰孢复合种进行亚种鉴定。结果表明,春玉米区禾谷镰孢复合种为禾谷镰孢菌和布氏镰孢菌,且以布氏镰孢菌为主。

在山西省临县、太谷县发现枣贮藏期红粉病,发病初期果实表面出现圆形或椭圆形的白色絮状霉点,后期形成较厚粉状霉层。从病样中分离获得2株代表性菌株,通过病原菌分离培养、致病性测定、形态学特征及ITS序列特征分析,确定引起枣贮藏期红粉病的致病菌为粉红单端孢(Trichothecium roseum)。适合该病菌分生孢子萌发的温度为20℃~25℃,相对湿度为大于75%,pH=4~10,致死温度为48℃、处理10 min。适宜芽管生长的温度为20℃~25℃,相对湿度为大于75%,最适pH=6。本研究结果可为枣贮藏期红粉病的诊断和防治措施的制定提供理论依据。

甘薯茎腐病是危害甘薯的一种严重病害,甘薯茎、叶柄、叶片和块根均可被害。该病典型症状是茎基部发黑和变软腐烂,叶发黄,茎和块根维管束黑褐色,引起块根腐烂、有臭味。通过对甘薯茎腐病典型症状样本的采集、病原菌的分离和纯化以及致病性测定,明确该病害是一种细菌病害。通过对甘薯茎腐病菌的菌体形态和培养特性观察发现,病原菌是革兰氏阴性细菌,菌体短杆状,大小约为2.36 μm×0.4 μm, 周生鞭毛,可在烟草上激发过敏性反应(HR)。Biolog测定、脂肪酸分析、16S rDNA序列分析、MALDI-TOF质谱鉴定和8个看家基因(dnaX、rplB、fusA、gapA、gyrA、purA、recA和rpoS)的序列系统发育分析,发现该病原菌与达旦提狄克氏菌Dickeya dadantii高度一致。这些结果说明,浙江省发生的小番薯病害是甘薯茎腐病,病原为D. dadantii。

在生物学检测的基础上,利用酶联免疫检测、非序列依赖性PCR(sequence-independent amp-lification, SIA)对感病番茄进行分子鉴定,表现卷叶和花叶症状的番茄均被黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)侵染,分离物分别命名为SXFQ(GenBank登录号为JX993914)和FQ(GenBank登录号为JX993912)。为明确其分类地位,对二者外壳蛋白(coat protein, CP)进行克隆和测序分析。应用DNAMAN软件对本课题组前期检测的7个CMV山西分离物、SXFQ、FQ以及其他3个CMV典型分离物CP序列进行比较分析,发现核苷酸和氨基酸序列最大相似性分别为77.1%~100%和81.6%~100%。氨基酸序列系统进化分析表明,9个CMV山西分离物属于CMV亚组I B的2个分支,其中在指示植物上表现较强症状的SXFQ与其他5个分离物为一分支,在指示植物上表现较弱症状的FQ与其他2个分离物为另一分支。对9个山西分离物CP进行亚组分类分析,结果表明其理化性质、稳定性、疏水性与预测结果相近,2个分支的分离物分别出现相近的氨基酸变异和蛋白结构,存在一定规律性。

利用筛选的11条ISSR引物对从我国柑橘主产区和国外收集的135株叶点霉属真菌菌株进行扩增,扩增产物进行凝胶电泳,扩增图谱用NTSYS-pc2.10软件进行群体聚类分析。结果显示,共扩增出116个DNA条带,其中多态性位点为112个,多态率为96.55%;平均每个引物可以扩增出10.55个条带,扩增产物大小在250~3 000 bp。聚类分析显示,中国柑橘叶点霉属真菌可以分为4个种,即P. citricarpa、 P. citriasiana、 P. capitalensis和P. citrichinaensis。以遗传相似性系数0.97为阈值时,柑橘黑斑病病原菌(P. citricarpa)种群可分为5个亚类,subclade-I的菌株来自中国的本地早、温州蜜柑、槾橘和南丰蜜橘,subclade-II的菌株均来自中国的砂糖橘,subclade-III的菌株来自非洲莫桑比克柠檬和葡萄柚、佛罗里达甜橙、南非甜橙和来自杭州市场上进口的澳橘,subclade-IV的菌株来自中国的甜橙,subclade-V的菌株来自中国的柠檬,表明我国柑橘黑斑病病原菌具有丰富的遗传变异,其遗传变异与寄主相关;我国与国外的柑橘黑斑病病原菌在起源上可能存在差异。P. citriasiana、 P. capitalensis和P. citrichinaensis种群内也存在遗传变异,但其遗传变异与地理分布和寄主未发现相关性。该研究结果为研究柑橘叶点霉属真菌的遗传多样性奠定了基础。

本研究基于环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification, LAMP),建立了一种快速、准确和灵敏的接骨木镰孢的检测技术。通过比对接骨木镰孢与其近源种之间的候选靶标序列,选取TEF1-α(translation elongation factor 1-α,翻译延伸因子)基因作为靶标,设计并筛选出一套对该病原菌具有种特异性的LAMP引物,建立了检测接骨木镰孢的 LAMP 体系。该体系在反应前加入染料羟基萘酚蓝(hydroxynaphthol blue,HNB),经62℃恒温反应70 min之后,可根据肉眼观察到的反应物的颜色判定结果。特异性分析结果表明,仅接骨木镰孢的DNA经检测后呈天蓝色的阳性反应,而其他供试菌株的DNA均呈紫色的阴性反应。该方法对DNA的最低检测限为100 pg·μL^-1。在采自内蒙古和黑龙江的28份马铃薯干腐病疑似病害样本中,检测到14份阳性样品。该方法的建立为接骨木镰孢的检测及其所致病害的诊断提供了快捷准确的技术。

OsNAC3是水稻NAC转录因子家族的一个成员,受MeJA、干旱、盐及冷胁迫诱导表达。OsNAC3与绿色荧光蛋白GFP的融合蛋白定位在烟草细胞核中。OsNAC3在酵母中具有转录激活活性,且转录激活域位于其C端;酵母双杂交和pull down证实OsNAC3可以形成同源二聚体。采用凝胶阻滞的分析方法,明确OsNAC3在体外能与NAC识别序列NACRS特异结合。研究结果为进一步揭示OsNAC3的生物学功能打下了基础。

马铃薯晚疫病黑龙江菌株效应分子PITG_21645.2在本氏烟(Nicotiana benthamiana)上可以抑制由INF1引起的过敏性细胞坏死(Hypersensitive response, HR)。为验证其为致病疫霉致病的重要效应分子,克隆了10个致病疫霉菌株以及3个同属卵菌菌株中的PITG_21645.2同源基因,它们在氨基酸序列上相似度为93%~100%。与INF1共表达的结果显示,仅有PITG_21645.2^MP903丧失了抑制HR的功能。其中PITG_21645.2^MP903的第31位氨基酸存在特异性,编码丝氨酸,其余同源基因在该位点均编码天冬酰胺。PITG_21645.2^MP903回复突变体(S31N)能够恢复该基因抑制INF1引起HR的功能,说明第31位氨基酸是影响抑制功能的关键位点。另外,PITG_21645.2还能抑制BAX、大豆疫霉PsojNIP和效应分子Avh238在本氏烟上激发的HR,而PITG_21645.2^MP903都丧失抑制功能。本氏烟上表达PITG_21645.2能够促进致病疫霉在寄主上的定殖,从而提示PITG_21645.2在致病疫霉的侵染中发挥致病性功能。

灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)可侵染1 400多种植物,给全世界农作物生产造成了严重的损害。BcMito-TTP蛋白是一种进化保守的线粒体羧酸盐转运蛋白,酿酒酵母中研究发现该羧酸盐转运蛋白主要负责催化柠檬酸盐通过线粒体内膜流出以交换羧酸盐H⁺离子等。本研究通过对BcMito-TTP基因进行敲除和功能互补发现,与原始菌株相比,敲除转化子生长速度没有差异,但产孢量有所降低,致病力明显减弱,菌核形成进程推迟。BcMito-TTP敲除转化子在添加CH₃COONa培养基中生长速度变慢且将BcMito-TTP基因互补可以恢复上述生物学性状。推测BcMito-TTP蛋白的缺失阻碍了CH₃COONa在灰葡萄孢体内的运输继而影响其孢子和菌核的形成,BcMito-TTP 基因参与灰葡萄孢致病力分子机制正在进一步研究之中。

水稻条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzicola, Xoc)成功侵染水稻主要依靠其III型分泌系统(Type III secretion system, T3SS)分泌的效应蛋白。T3SS由hrp-hrc-hpa基因编码,其中主要的hrp和hrc基因突变,病原菌将丧失在寄主水稻上的致病性和非寄主烟草上的过敏性反应(hypersensitive response, HR)。hrpD5基因位于hrp基因簇hrpD操纵单元的第5个基因,在致病性中的功能未知。本研究构建了Xoc的hrpD5缺失突变体RΔhrpD5。植物接种试验显示,RΔhrpD5 丧失了对寄主水稻的致病性和在非寄主烟草上激发HR反应的能力;功能互补子虽然能够恢复这2种表型,但是,与野生型菌株相比,其在感病水稻上的毒性显著降低,在非寄主烟草上形成延迟的HR反应;荧光定量PCR结果显示:hrpD5缺失影响其下游hrpD操纵单元基因hrpD6、hrpE和hpaB以及HrpX操纵单元基因hrpF和hrpB1的表达;同时,hrpD5缺失降低了hrpX的mRNA水平,但是不影响hrpX的启动子活性;酵母双杂交结果显示,HrpD5蛋白能够与HrpF蛋白的N端互作。这些结果暗示在Xoc中hrpD5不仅为主要的致病相关基因,而且调控主要的hrp调节基因hrpX的表达。HrpD5新功能的鉴定将为解析T3SS在致病性中的功能提供线索。

由茄丝核菌(Rhizoctonia solani)引起的纹枯病是水稻生产中的重要真菌病害,严重影响水稻产量及品质。本研究评估了两株哈茨木霉菌株3S1-13和4S2-46对纹枯病生防潜力及其对水稻种子萌发和幼苗生长的促生效果。研究表明两株哈茨木霉菌株在马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)上不产生分生孢子,但在含有1%酵母粉的PDA上能恢复产分生孢子的能力。菌株3S1-13和4S2-46发酵液对茄丝核菌的菌丝生长及菌核形成均有较强抑制作用,具有防治水稻纹枯病潜力,且发酵液防效显著高于孢子液的防效。菌株3S1-13和4S2-46发酵液处理后的水稻种子发芽率和幼苗的根系、鲜重均显著高于对照,显示出有利于促进种子发芽与生长的作用。研究结果表明两株哈茨木霉菌株发酵液不仅可以用于水稻纹枯病的生物防治,而且可以促进水稻种子发芽及生长,具有较好的应用潜力。

为探明半裸镰孢对接种后苜蓿种苗的致病性、筛选抗苜蓿根腐病的品种,本研究把4个来源地的9个半裸镰孢分离物接种于14个品种的紫花苜蓿种子,在接种后第14 d测定苜蓿幼苗的相对根长、相对苗高、相对发芽率和病情指数,评价不同苜蓿品种对半裸镰孢的抗病性及病原菌对苜蓿幼苗致病性的相互关系。结果表明:半裸镰孢菌株和苜蓿品种对相对根长、相对苗高、相对发芽率及病情指数均有显著的影响(P<0.05)。病原菌方面,从苜蓿品种THG-1中分离出来的半裸镰孢的致病性最强,从Aohan中分离出来的半裸镰孢的致病性最弱,从WL-323HQ、Sitel和Siriver中分离出来的半裸镰孢的致病性较强,从Reindeer、Legacy和LM400中分离出来的半裸镰孢的致病性较弱;苜蓿品种方面,Algonguin的抗病性最强,Phabulous的抗病性最弱,Verna、Victoria、Hunter river和Amerimultileaf的抗病性较强,WL-323HQ、Sanditi、Sandy和Amerilea721的抗病性较弱。

Surfactin是由芽胞杆菌类细菌产生的一种脂肽类物质,具有溶血活性和排油能力,并且与细菌生物膜形成和根际定殖能力相关。本研究分析了PhoR/PhoP双组份对生防枯草芽胞杆菌NCD-2菌株中surfactin合成的影响。在低磷环境下,同NCD-2野生型菌株相比,PhoR和PhoP突变子显著降低了NCD-2菌株的溶血活性;NCD-2菌株的排油能力很强,而PhoR和PhoP突变子均丧失排油能力;NCD-2野生型菌株的生物膜形成能力分别是PhoR和PhoP突变子的2.0和2.2倍。通过FPLC色谱分析技术证明NCD-2菌株可以产生surfactin,并发现在低磷条件中,野生型菌株NCD-2所产生的surfactin分别是PhoR和PhoP突变子的2.3和6.4倍。通过RT-qPCR技术分析了surfactin合成酶基因srfAA在不同菌株中的表达情况,结果表明在低磷环境下,PhoR和PhoP突变子中srfAA基因的表达量比NCD-2野生型菌株均降低了2.1倍。构建PhoR和PhoP突变子的互补菌株,证明互补菌株均能使突变子的性状恢复到野生型水平。以上结果证明,PhoR/PhoP双组份影响surfactin的合成。

探究南方根结线虫Me3毒性与非毒性群体对抗感寄主趋向性和侵染能力,为揭示毒性群体致病机理及防治根结线虫策略提供理论依据。使用以水琼脂为介质的研究方法,通过对比分析辣椒抗病品种HDA149和感病品种茄门根尖附近聚集的2龄幼虫(J2)数量,来揭示南方根结线虫对抗感辣椒品种根尖的趋向性效应,并利用实时荧光定量 PCR 检测侵入到辣椒根系的毒性与非毒性线虫数量,对其侵染能力进行比较。J2 趋向性试验结果显示,在相同的时间点,HDA149 和茄门辣椒根尖处附近聚集的毒性群体 J2 数量总是显著多于非毒性群体的 J2数量;J2 对抗感辣椒的选择性结果表明,不论是毒性群体还是非毒性群体的 J2,在相同的时间点,茄门根尖附近聚集的线虫数量显著多于HDA149根尖附近的线虫数量;荧光定量 PCR 检测线虫侵染结果显示,毒性群体 J2侵入到辣椒根系的数量相对非毒性群体的 J2 更多。总之,相比南方根结线虫Me3非毒性群体,毒性群体的 J2 对寄主根系有较强的趋向性,并且侵染效率更高;相比于抗性寄主,Me3毒性群体和非毒性群体的 J2 对感病寄主有更强的选择性。

Fusarium wilt of banana, caused by Fusarium oxysporum f. sp. cubense tropic race 4 (Foc TR4), is a typical vascular and soil-borne disease which has significantly threatened the sustainable development of banana industry. In order to reveal the infection process and pathogenesis of Foc TR4, the young mycelia (66.7 mg·mL^-1) of wild-type strain of Foc TR4 (WT-Foc TR4) cultured for 18-20 h were lysed with enzyme mixture for protoplasting, which consisted of 25 mg·mL^-1 driselase, 0.4 mg·mL^-1 chitinase, 15 mg·mL^-1 lysing enzyme and 1.2 mol·L^-1 potassium chloride. The resulted protoplasts of 2×10⁷cells·mL^-1 were used to test the efficiency of transformation mediated by polyethylene glycol, and up to 9 transformants per μg DNA were obtained. AmCyan, RFP and YFP gene were stably transferred into WT-Foc TR4, separately, using the protoplasts transformation system. The gene FoOCH1 encoding α-1,6-mannosyltransferase in WT-Foc TR4 was knocked out using the split-marker recombination technology. The genetic transformation and gene knockout system in this pathogen laid the foundation for the study of functional genomics and plant-pathogen interactions.

The gene MoHYR1 is important for full virulence and H₂O₂ tolerance in the rice blast fungus Magnaporthe oryzae. MoHYR1 was obtained by PCR with the template of M.oryzae cDNA and cloned into a prokaryotic expression vector pHAT2. The protein MoHYR1 was successfully expressed in strain Escherichia coli BL21(DE3) with an estimated molecular mass of 20 kDa. The protein was then purified by affinity chromatography and gel filtration. Finally, high purity of MoHYR1 was obtained, which contributes to further study on its structure and function.

Fusarium oxysporum f.sp. vasinfectum(Fov)已报道有8个生理小种和一个澳大利亚生理型,在我国只报道有3、7、8号小种。前期研究发现,我国还有一个与3、7、8号小种具有较大遗传差异的Fov新生理型。本研究通过对3、7、8号小种和新生理型菌株的翻译延伸因子(EF-1α)基因序列比对分析,发现该新生理型菌株具有特异性碱基序列。根据这些特异性碱基序列,设计了一对针对新生理型菌株的特异性引物,并证明该引物可以特异性检测Fov新生理型菌株。利用该引物对采自河北省主要植棉区的77株Fov菌株进行筛选,鉴定出2株潜在的新生理型菌株。从这2个Fov菌株中克隆出EF-1α和β-tubulin基因序列,通过构建系统发育树,证明这2个Fov菌株为新生理型菌株,而且与澳大利亚生理型菌株具有较近的亲缘关系。本研究建立的分子检测方法可用于棉花枯萎病菌新生理型菌株的鉴定。

柑橘生长中后期、运输和贮藏期间由真菌危害造成的烂果现象十分普遍。2016年对采集自江西赣州果园的柑橘病果进行了组织分离、柯赫氏法则验证和病原菌鉴定,明确病原菌为葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea)。进一步发现该病菌可以侵染苹果枝干和果实,引起腐烂。这是首次关于B. dothidea侵染柑橘果实的报道。

在广东省雷州市发生一种南瓜(Cucurbita moschata)叶枯病,病株叶片边缘开始出现水渍状病斑,逐步发展成大病斑,后期病斑焦枯;在叶片上也可形成近圆形水渍状病斑,伴有黄色晕圈,后期病斑联合形成不规则大枯斑;叶柄和匍匐茎被侵染后呈水渍状腐烂。从病斑上分离到一种细菌,在KB培养基上,菌落为椭圆形,乳白色,半透明,边缘参差不齐,紫外灯照射下产生荧光反应。致病性测定结果表明,该病原细菌可侵染6个南瓜品种引起与田间症状相同的叶枯病。生理生化试验结果表明,该病原细菌与丁香假单胞丁香致病变种(Pseudomonas syringae pv. syringae)的特性一致。应用假单胞菌属特异引物Ps-for/Ps-rev和丁香假单胞丁香致病变种组群特异性引物Group III-F/Group III-R,可从该病原细菌中扩增出预期大小分别为1 018 bp和750 bp的目的片段。应用丁香致病变种syrB基因特异性引物B1/B2,可从该病原菌中扩增出预期大小为750 bp的丁香霉素基因片段。基于16S rDNA与gyrB基因序列系统进化分析均表明,南瓜叶枯病菌株与已报道的P. syringae pv. syringae菌株HS191(CP006256)亲缘关系最近,二者聚类在一起形成一个小分支。人工接种条件下,该病原细菌还可侵染西葫芦、丝瓜、茄子、番茄、菜豆、扁豆等植物。这些结果表明,引起广东省南瓜叶枯病的病原为丁香假单胞丁香致病变种(Pseudomonas syringae pv. syringae)。这是首次在中国发现丁香假单胞丁香致病变种引起南瓜叶枯病。

稻曲病是由稻绿核菌(Ustilaginoidea virens)侵染引起的水稻穗部病害,在全世界不同稻作区均有发生,并在近年呈加重趋势。本研究通过水稻穗期接种后的显微观察及H₂O₂检测,分析了稻曲病菌侵染引起的小穗结构变化及侵染过程中H₂O₂变化趋势。结果表明,稻曲病菌侵染会导致水稻花粉粒畸形、雌蕊发育受抑制、小穗无法正常扬花授粉,抑制谷粒的正常形成,造成稻曲球及白色秕粒的产生。受侵染小穗的H₂O₂含量显著高于对照,其中处于突破颖壳期的受侵染小穗H₂O₂含量是对照的7倍;形成白色秕粒的小穗H₂O₂含量是对照的11倍;二氨基联苯胺染色结果显示,形成稻曲球的小穗中,在受侵染小穗的花药基部、花药顶端、浆片等部位颜色变深,形成H₂O₂富集区;形成白色秕粒的小穗中,H₂O₂富集的特征更为明显,富集区域与病菌在小穗内的侵染途径密切相关。

Cop基因簇是黄单胞菌属抗铜的主要基因位点,而水稻白叶枯病菌PXO99相对其他菌株对铜离子更加敏感。本研究发现抗铜基因CopAB的6个氨基酸自然缺失突变是造成PXO99对铜离子敏感的主要因素。通过对CopAB的缺失突变体和恢复抗铜能力的重组菌株的耐铜实验和接种实验,证实了CopAB不仅参与黄单胞杆菌的抗铜功能,同时作为一种致病因子参与黄单胞杆菌与水稻的互作。为验证CopAB基因的功能,从国内白叶枯病菌分离菌株中筛选到4株对铜离子敏感菌株,并证实其CopAB基因也发生相似的突变。同时,恢复抗铜能力的PXO99互补菌株并不能克服xa13介导的抗性,而分离到的4株铜离子敏感的菌株中,3株不含PthXo1的菌株在IR24和IRBB13上致病性相当,说明PXO99对铜离子的敏感性与xa13基因介导的对PXO99专化抗性没有直接的关系。

对云南嵩明百合上发生的百合斑驳病毒(Lily mottle virus, LMoV)进行全基因组序列测定及分析,并对LMoV嵩明分离物(LMoV-SMi1、LMoV-SMi2)和玉溪分离物(LMoV-YXi1、LMoV-YXi2)外壳蛋白(coat protein,CP)基因进行序列比较,发现云南的LMoV分为2个类群,玉溪分离物属于种群I,嵩明分离物属于种群II。2个类群间的核苷酸和氨基酸同源性分别为86.7%~89.5%、90.1%~92.7%,玉溪分离物和嵩明分离物相比,cp基因发生了3个核苷酸的缺失。对国内外LMoV所有分离物的cp基因氨基酸序列进行系统进化分析,结果表明所有LMoV分离物可划分为2个种群,种群I分离物较种群II分离物几乎均存在1个苏氨酸缺失的差异。此外,对LMoV-SMi2的CP相关特性和空间结构进行了初步预测,认为该蛋白为球状,具有较强的表面可能性,不存在跨膜区域,大多数区域能够形成主要的抗原决定簇,主要集中在aa12-22、aa31-42、aa83-99、aa179-191、aa215-223、aa249-259区段,可作为制备抗血清选择抗原的参考。LMoV-SMi2和LMoV-YXi1在二级结构和三级结构上存在一定的差异,但总体空间结构差异不大。

为了解四川省近年小麦生产品种和后备品种对条锈菌致病类型G22-83和流行小种CYR32、CYR33的抗性水平,明确已知的主要抗条锈基因在该地区小麦品种中分布状况,利用小麦条锈菌G22-83、CYR32和CYR33对四川省100个小麦品种(系)进行苗期抗病性鉴定;采用已知基因Yr5、Yr9、Yr10、Yr15、Yr18 和Yr26的分子标记,对供试小麦材料进行抗性基因检测。结果表明,100个供试材料中,对CYR32 表现抗病的58份,占58%;对CYR33 表现抗病的63份,占63%;对G22表现抗病的43份,占43%;对CYR32、CYR33和G22均表现抗病性的品种(系)28个,占28%。供试小麦品种(系)中携带Yr9、Yr10、Yr15 和Yr26基因的材料分别有24份(24%)、9份(9%)、5份(5%)和26份(26%),所有供试品种(系)中未检测到Yr5和Yr18基因。

水稻稻粒黑粉病主要为害水稻不育系,是限制我国南方杂交水稻制繁种产量和质量的主要病害因素。为挖掘抗稻粒黑粉病的水稻不育系品种,提供具有抗稻粒黑粉病育种价值的水稻不育系材料,本研究于2014—2016年,采用田间接种稻粒黑粉病菌的方法,对四川、湖北、福建的78个水稻不育系品种进行了稻粒黑粉病菌抽穗期抗性评价。连续3年接种稻粒黑粉病菌试验表明,共有4个水稻不育系品种对稻粒黑粉病表现中抗及以上抗性,大部分为感病品种,其中4766A接种稻粒黑粉病菌后未发病,对稻粒黑粉病表现稳定高抗,为我国首次报道的高抗稻粒黑粉病水稻品种。

为了探明锐顶镰孢菌对接种后苜蓿种苗的致病性,本研究采用菌饼接种法,将分离自4个地点的15个锐顶镰孢菌株接种于14个紫花苜蓿品种的种子上,接种后14 d 测定相对根长、苗高、发芽率,并计算病情指数。结果表明,参试的15个菌株均显著降低了苜蓿种苗的根长(P<0.05)。总体来看,各菌株之间的致病性有所不同,从苜蓿品种WL-323HQ中分离出来的5号菌株的致病性最强,从WL-525HQ中分离出来的13号菌株的致病性最弱,从WL-525HQ、Legacy、Affinity和Millionaire中分离出来的12号、10号、8号和6号菌株的致病性较强,从Aohan、Farmers、WL-323ML和Dingdian中分离出来的1号、4号、7号和9号菌株的致病性较弱;参试的14个苜蓿品种之间的抗病性也各不相同,Amerimultileaf的抗病性最强,Amerileaf721、Victoria、Powerplant和Legacy的抗病性较强,Sandy、Phabulous、Hunter river和Alfaking的抗病性较弱,Vernal的抗病性最弱。

分别利用近地高光谱和低空航拍数字图像同时对田间小麦条锈病的发生情况进行监测,结果表明近地高光谱遥感参数DVI、NDVI、GNDVI和低空航拍数字图像颜色特征值R、G、B与病情指数存在极显著相关性,整体上,所选近地高光谱参数与病情指数的相关性要优于低空航拍数字图像参数与病情指数的相关性,而且近地高光谱参数DVI、NDVI、GNDVI与低空航拍数字图像参数R、G、B之间均存在极显著负相关关系。分别建立了基于近地高光谱参数GNDVI和低空航拍数字图像参数R的田间小麦条锈病病情估计模型,模型均达到较好的拟合效果,其中近地高光谱参数GNDVI对小麦条锈病的监测效果好于低空航拍数字图像参数R,而低空航拍数字图像具有可以进行大面积快速监测的优势,因此在实际应用中可以根据需要选择其中一种方法或参数来估计田间小麦条锈病的发生和流行程度。

草莓灰霉病是由灰葡萄孢(Botrytis cinerea Pers.)引起的一种真菌病害,可造成草莓烂果,严重影响草莓产量和采后保存。为了探明日光温室草莓灰霉病的发生流行规律,在2013—2014年生长季和2014—2015年生长季,对北京地区草莓日光温室空气中灰葡萄孢分生孢子数量、草莓花瓣带菌率和灰霉病病果数进行了动态监测和调查,同时对日光温室中气象因子进行了系统监测和记录。结果表明,在草莓日光温室中,利用孢子捕捉器捕获的灰葡萄孢分生孢子数量在一天中主要集中在5:00-18:00,以11:00-14:00数量最大。在一天中每小时捕获的分生孢子数量与温度和光照强度呈极显著正相关(P≤0.01),与相对湿度呈极显著负相关(P≤0.01)。新增草莓灰霉病病果数与7 d前当天捕获的分生孢子数量呈极显著正相关(r=0.872,P≤0.01),与7 d前当天的新鲜花瓣带菌率亦呈极显著正相关(r=0.807,P≤0.01),这为利用捕获的分生孢子数量和新鲜花瓣的带菌率预测7 d后草莓灰霉病的发生情况提供了重要参考。本研究结果有助于了解日光温室中草莓灰霉病的发生规律和影响因素,为该病害的防控和预测测报提供了依据。

菲利普孢囊线虫Heterodera filipjevi是禾谷类作物上重要的病原线虫之一,严重影响禾谷类作物的产量和品质。本课题组前期研究发现菲利普孢囊线虫许昌群体是一个新的致病型,其在小麦上的致病力强于其他多个群体,危害更为严重。本研究旨在建立菲利普孢囊线虫许昌群体的快速、准确的分子检测体系,为Heterodera filipjevi许昌群体的监测和防控及抗病品种的选育利用奠定基础。本研究采用随机扩增多态性 DNA(RAPD)和序列特征扩增区域(SCAR)的方法,对黄淮麦区5个重要小麦孢囊线虫致病型共9个线虫群体进行RAPD分析和SCAR标记转化,并通过增加除黄淮麦区外的线虫群体验证所获得的致病型相关分子标记的特异性和有效性。本研究共筛选了331条RAPD引物,筛选出2个菲利普孢囊线虫许昌群体相关的RAPD标记,引物S86可以扩增出1条约550 bp的多态性片段,引物S178可以扩增出1条约1 200 bp的多态性片段,并将这2个RAPD标记成功转化为SCAR标记。SCAR标记的特异性检测结果表明这两个SCAR标记只在许昌群体上有特异性扩增, 可以用于许昌群体的分子检测。

棉花黄萎病菌致病力测定及评价是抗病育种及病害综合防治的基础。本文以我国三大棉区的167个黄萎菌菌株为对象,研究致病力测定及评价中不同批次之间病情指数的校准及致病力类型划分标准等关键技术环节。结果表明,以中等致病力类型菌株Vd076为校正菌株,以感病性稳定的冀棉11为校正鉴别寄主,以校正菌株在校正鉴别寄主上病情指数达到50.0±5.0时的调查结果进行各菌株的致病力评价,可获得较好的校正效果,使不同批次试验数据具有可比性;依据聚类分析结果,制定了致病力类型划分标准,强、中、弱3种致病力类型的平均校正病指分别为﹥40.0、20.1~40.0和20.0;通过对不同鉴别寄主组合的分析,推荐陆地棉中棉所41号、豫棉21、鲁棉研28、中棉所35号、中棉所8号、冀棉11作为鉴别寄主。该研究为棉花黄萎病菌致病力变异等相关研究工作提供了技术支撑。

水稻恶苗病是水稻上的重要病害,在我国各水稻主要种植区均有发生,造成水稻产量的严重损失。Fusarium andiyazi是近年来国外报道的水稻恶苗病的病原菌之一,本研究基于环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP),以F. andiyazi的TAT(trichothecene 3-O-acetyltransferase)基因为靶标设计并筛选出一套灵敏、特异的LAMP引物,建立了可快速诊断该病菌所引起的水稻恶苗病的LAMP检测技术。在等温条件下(64℃)只需进行核酸扩增反应80 min,反应前向体系中加入了金属离子指示剂HNB(羟基萘酚蓝),反应后即可肉眼观察反应产物颜色变化判断检测结果,阳性反应呈天蓝色,阴性呈紫色。该TAT-Fan-LAMP技术的最低检测灵敏度为100 pg·μL^-1。应用该技术成功地对南京江宁和镇江句容田间采集的由F. andiyazi引起的水稻恶苗病进行快速诊断。该LAMP检测技术的建立为F. andiyazi引起的水稻恶苗病的诊断提供了简便快速的新技术。

由西瓜嗜酸菌(Acidovorax citrulli)引起的细菌性果斑病是一种毁灭性的种传病害,可为害多种葫芦科作物并造成重大经济损失。该病原菌为检疫性有害生物,种子带菌是田间病害发生的最重要初侵染来源,因此,种子健康检测成为病害综合防控过程中的重要环节。Bio-PCR是当前种子携带细菌检测的常用方法,而特异性引物的选择和使用是检测的关键。本研究使用已报道的7对引物对17株西瓜嗜酸菌、10株嗜酸菌属其它种的菌株和6株其它属的植物病原细菌进行了Bio-PCR检测,筛选出对西瓜嗜酸菌特异性最好的引物为SEQID4^m/SEQID5。研究表明:使用该引物对西瓜嗜酸菌MH21纯菌菌悬液的检测限度为10² CFU·mL^-1;在人工添加菌悬液的模拟带菌西瓜种子中,使用ASCM和EBBA两种半选择性培养基结合引物SEQID4^m/SEQID5进行Bio-PCR检测,ASCM对种子中带菌量的检测限度可达到0.01 CFU·g^-1,EBBA对种子中带菌量的检测限度为0.1 CFU·g^-1。

A new fungal disease of stem wilt was found on Polygonum capitatum. The isolate was obtained from diseased field sample. This study was to identify and characterize the isolate. Based on analysis of ITS, EF-1α and β-tubulin sequences, the isolate was placed in Fusarium equiseti clade in phylogenetic tree. In combination of morphological characteristics the fungal isolate was identified as F. equiseti, a new pathogen on Polygonum capitatum. To determine the optimal nutritional and cultural conditions for the pathogen, the biological characteristics test was conducted. The results showed that the optimal carbon and nitrogen sources were fructose and sodium nitrate, respectively, and the mycelia was not sensitive to light with the optimum growth temperature was at 28℃ and favorable pH value at 7, while the lethal temperature for mycelia growth was 65℃ for 10 minutes.

Lr26 and Lr19 are two known important wheat leaf rust resistance genes. The positive and negative markers of the two genes have been developed at present. A total of 17 commercial wheat cultivars collected from Sichuan province were inoculated with 14 Chinese Puccinia triticina races for gene postulation in the greenhouse and used to detect Lr26 and Lr19 by multiplex PCR, respectively. The results showed that Lr26 was detected in six wheat cultivars, and no cultivar was found to carry the Lr19 gene. The multiplex PCR can be widely used for marker-assisted selection of Lr26 and Lr19.

Gummy stem blight,usually seen on the stems, leaves and fruits, is one of the most serious threats to production of balsam pear (Momordica charantia L.) in Guangxi with reduction of the quality and heavy losses in yield. The pathogenic organisms of the disease were still obscure because several fungal species with most similar morphology were reported to be the causative agents. In this paper, the isolate in imperfect stage from the samples of gummy stem blight of balsam pear in Guangxi was identified as Stagonosporopsis cucurbitacearumbased on the morphological characteristics, inoculation experiments and phylogenetic analysis with rDNA-ITS sequences.

Papaya ringspot virus (PRSV) is a major limiting factor to cucurbit production worldwide. One zucchini sample showing symptoms of leaf mosaic and fruit ringspot was collected from Ji’nan city of Shandong province. Primary experiments showed that the sample was infected with PRSV, which was designated as PRSV-SD accordingly. The complete genomic fragment of PRSV-SD was obtained with RT-PCR. The results of sequencing showed that the full genomic sequence of PRSV-SD was 1 0337 nucleotides (nt) excluding the 3′- terminal poly (A) tail. The 5′- and 3′-untranslated regions (UTR) were 90 and 206 nt, respectively. The putative polyprotein was 3 346 amino acids in length. Comparison of the PRSV-SD isolate with 18 other PRSV isolates revealed that they shared nucleotide identities of 82.1%~89.3% at the complete genomic levels and amino acid identities of 90.6%~94.7% for the polyprotein. No recombination was detected throughout the genome of PRSV-SD. Phylogenetic analysis with complete genomic sequences indicated that the PRSV isolates were clustered into two major groups: Asia and America and PRSV-SD was clustered to the Asia group. Selection pressure analysis revealed that all of the 11 proteins of PRSV-SD were under negative selection, but positive selection sites were detected in P1, P3, 6K1, NIa-pro and NIb. Our research results provide a theoretical foundation for the detection and prevention of PRSV. Key words:Papaya ringspot virus; complete genomic sequence; phylogenetic analysis; selection pressure; recombination 中图分类号:S436.429; Q939.46 文献标识码:A 文章编号:0412-0914(2018)02-0285-04 番木瓜环斑病毒(Papaya ringspot virus,PRSV)属于马铃薯Y病毒科(Potyviridae)马铃薯Y病毒属(Potyvirus)^[1]。根据寄主范围可划分为P和W 2个株系,其中P株系侵染番木瓜(Carica papaya L.)和葫芦科(Cucurbitaceae)作物,而W株系只侵染葫芦科作物,两者血清学反应密切相关。PRSV可引起植株叶片褪绿、花叶、卷曲等症状,在果实表面形成环斑。    PRSV于20世纪40年代末在美国首次报道,目前该病毒在巴西、印度、波兰等国均有发生^[2]。2000~2001年,PRSV使我国海南番木瓜损失严重。2005年以来,我国广东、四川先后检测到PRSV侵染罗汉果、苦瓜等葫芦科作物^[3]。2016年从山东西葫芦上检测到PRSV,该分离物属于W株系^[4]。我国关于PRSV进化的研究大多集中于P株系,有关W株系全基因组序列分析的报道相对较少。为了进一步研究我国PRSV-W株系的基因组特性,为PRSV的监测预警提供依据,我们测定了PRSV山东分离物的全基因组序列,并进行了核苷酸和氨基酸序列一致率、重组、系统发育和基因选择压力分析。 2期黄显德,等:番木瓜环斑病毒山东分离物的全基因组序列分析      植物病理学报48卷 1 材料与方法 1.1 材料 发病西葫芦样品采自山东省济阳县。大肠杆菌DH5α由本实验室保存。植物总RNA提取试剂盒TRIzol、DNA凝胶回收试剂盒等均购自北京全式金公司;Taq DNA聚合酶、 pMD18-T克隆载体等购自TaKaRa公司;SuperScript^TM Ⅳ逆转录酶购自Invitrogen公司。其他生化试剂及普通化学试剂均为进口或国产分析纯。 1.2 实验方法 1.2.1 扩增策略及引物合成 根据GenBank中PRSV基因组序列,设计引物分4段扩增基因组序列。根据所得序列设计5′-RACE引物扩增5′-端片段。测序后用SeqMan拼接得到全基因组序列。所用引物详见表1。 1.2.2 植物总RNA提取及RT-PCR扩增 按照RNA提取试剂盒说明书进行植物总RNA提取。以总RNA为模板,用随机引物反转录合成cDNA。通过4次PCR和5′-RACE扩增PRSV-SD基因组片段。 1.2.3 克隆及序列测定 电泳分离PCR产物,切胶回收后连接到pMD18-T载体上,转化E. coli DH5α感受态细胞,挑选阳性克隆进行核苷酸测序。

拟禾本科根结线虫是严重影响水稻产量的植物寄生线虫之一,已成为制约中国及亚洲地区水稻产量的重大问题。拟禾本科根结线虫寄主范围广泛,可危害高地、低洼地和深水水稻;通过巨细胞从水稻根中摄取营养物质,从而在根系上形成许多弯钩状根结;其食道腺分泌物可以直接对水稻产生危害,影响水稻细胞代谢和免疫,从而影响水稻产量。目前水稻抗根结线虫病的品种较少,主要通过化学药剂在苗床进行防治。本文对拟禾本科根结线虫的寄主范围、危害特性、侵染特点、致病机制及防治方法等进行了综述,并对将来通过基因编辑等遗传工程技术提高水稻品种抗性的策略进行了展望,以期为我国水稻拟禾本科根结线虫的防治提供理论依据。

为明确我国南方杂交水稻制繁种区稻粒黑粉病病原菌及其致病力情况,于2015年8月从安徽、湖南、江苏、贵州、四川遂宁、四川新津、四川温江7个主要杂交稻制繁种区采集稻粒黑粉病样本,采用冬孢子悬浮液分离法进行病原菌的分离。基于形态学、菌丝细胞核荧光染色和rDNA-ITS序列分析对病原菌进行鉴定,并应用柯赫氏法则对不同地区病样中分离的纯培养物致病性进行测定。结果表明分离到的35株病原菌菌株并无明显形态学差异,冬孢子呈球形或椭圆形,次生小孢子单细胞核,呈线状或弯曲状两种类型,与已报道的黑粉菌属Tilletia horrida形态特征相似;rDNA-ITS序列分析表明,选取的7株病原菌菌株与T. horridaDQ827699同源性达100%,说明所分离菌株为稻粒黑粉病菌;致病性试验表明,7株病原菌菌株侵染水稻稻粒均能产生稻粒黑粉病的典型症状,其中分离自江苏的菌株JS造成的单穗病粒数和产量损失最大,致病力较强,且萌芽率最高,分离自不同地区的菌株致病力具有明显差异。该7株病原菌最适生长温度为28℃,光照对其生长没有明显影响。

2013～2016年从全国12个省市采集不同花生白绢病样本,共分离获得39个分离物,对其ITS-rDNA序列进行了分析,表明它们均属于齐整小核菌(Sclerotium rolfsii);这39个分离物分为两个亚组,分别包含22个和17个菌株;对这39个菌株进行了菌丝亲和群分析及相关生物学特性比较,共鉴定出23个菌丝亲和群;8个亲和群包含2~6个菌株,其余的15个亲和群都只包含1个菌株;同一菌丝亲和群的菌株菌落形态相似,大多数菌株的菌丝生长速度、菌核大小比较相近,个别菌株差异较大;39个菌株均能产生草酸,在菌落形态、菌丝生长速度、菌核大小和重量上均有差异,生长速度为0.47～2.32 cm·d^-1,菌核直径为0.71～1.87 mm,单粒菌核干重为0.24～2.64 mg。

闽楠是我国特有珍稀优良用材乡土树种,市场前景广阔。叶斑病是闽楠推广种植过程中新出现的叶部病害,可影响树木正常生长。闽楠叶斑病病原鉴定及生物学特性等研究,有助于明确病原分类地位和病害发生流行规律,从而科学有效地指导防治。通过形态学特征观测和rDNA-ITS序列分析,确定闽楠叶斑病病原为小孢拟盘多毛孢(Pestalotiopsis microspora)。生物学特性测定结果表明:闽楠小孢拟盘多毛孢ZZ-03菌株以Czapek或PDA+PBL培养基(pH 6.0)28℃黑暗恒温培养有利于菌丝生长;以PDA培养基(pH 8.0)28℃黑暗恒温培养有利于菌株产孢;以pH 8.0、28℃、全黑暗有利于分生孢子萌发;以葡萄糖为C源、牛肉浸膏为N源有利于菌丝生长,以葡萄糖为C源、蛋白胨为N源有利于产孢;分生孢子萌发与相对湿度呈正相关。