猕猴桃采后腐烂在我国发生普遍。本试验对来自陕西、四川、湖北、山东和江西五省的773个猕猴桃病果进行组织分离,获得739个真菌分离株。经ITS序列比对及代表菌株的科赫式法则验证,确定其中722个菌株为猕猴桃采后腐烂病病原,属于以下11个属:Botryosphaeria、Diaporthe、Neofusicoccum、Alternaria、Botrytis、Fusarium、Cladosporium、Sclerotinia、Rhizopus、Lasiodiplodia和Pestalotiopsis。以Botryosphaeria dothidea和Diaporthe spp. 为优势种群,分别占总病原数的45.29%和45.15%。病原多样性分析显示,相同产区猕猴桃采后腐烂病病原种类相似。

甘蔗白条病是一种检疫性病害,在我国多个蔗区均有报道,严重威胁我国甘蔗生产。本研究对采自广西蔗区不同品种(系)的病原菌进行分离、鉴定、保存,并选取其中40份白条黄单胞菌分离物进行遗传多样性分析与接种试验,评价其致病性。根据三磷酸腺苷结合盒转运蛋白等管家基因和IV型分泌系统virB基因的序列差异和进化树分析,将40个菌株分为两个类型;调查分析接种植株发病症状及病情指数,确定40份病原菌的致病力存在明显差异,致病力强的菌株有5个,中等4个,其他31个菌株表现弱致病力。

滇重楼(Paris yunnanensis)是主要分布在我国西南地区尤其是云南的珍贵药材。2016年,从云南省德宏州芒市的滇重楼种植基地上观察到叶片斑驳、皱缩、坏死和花叶的滇重楼罹病植株。利用马铃薯Y病毒属(Potyvirus)、烟草花叶病毒属(Tobamovirus)、黄症病毒属(Luteovirus)和菜豆金色花叶病毒属(Begomovirus)病毒的通用引物和重楼X病毒(paris polyphylla virus X,PPVX)的特异引物,对采集的13份滇重楼样品进行病毒检测,结果发现利用马铃薯Y病毒属的通用引物CIFor/CIRev,能从罹病植株中扩增到与引物设计相符的条带。将目标产物克隆、测序,结果显示与辣椒脉斑驳病毒(chilli veinal mottle virus, ChiVMV)云南烟草分离物在ci基因核心区域具有99%的核苷酸序列一致性,表明染病滇重楼有ChiVMV的侵染。利用ChiVMV的特异引物,对2016—2018年采自云南省保山市龙陵县、德宏州芒市、怒江州泸水县、丽江市古城区、迪庆州香格里拉市和四川省攀枝花市盐边县的93份滇重楼样品进行RT-PCR检测,结果除泸水县采集的8个样品没有检测到ChiVMV外,其他5个地区采集的85个样品中有25个检测到ChiVMV的侵染。将ChiVMV丽江分离物及迪庆分离物的PCR产物进行克隆和测序,序列分析显示2个ChiVMV滇重楼分离物(YLJ-CL1,MW408193;YDQ-CL1,MW404246)在部分NIb基因及完整cp基因共1 269 nt的区域,具有相互间100%的核苷酸序列一致性,以及与ChiVMV其它分离物相应区域82.4%~99.1%的核苷酸序列一致性。利用不同ChiVMV分离物中该区域1 269 nt核苷酸序列构建的系统发育树,表明侵染滇重楼的ChiVMV分离物与侵染云南烟草的ChiVMV分离物亲缘关系最近。这是ChiVMV在重楼属(Paris)乃至黑药花科(Melanthiaceae)植物上的首次报道。

多主棒孢霉(Corynespora cassiicola)是世界范围内重要的植物病原真菌,其引起的草莓棒孢霉叶斑病对草莓产业的健康发展具有潜在威胁。小柱孢酮脱水酶(scytalone dehydratase,SCD)是真菌多聚二羟萘类(DHN)黑色素生物合成途径中的关键酶,在植物病原菌致病过程中发挥重要作用。本研究通过同源重组的方法获得了草莓多主棒孢霉小柱孢酮脱水酶基因(CcSCD1)的敲除突变体,并进行了回补和RT-PCR验证。与野生型相比,敲除突变体△CcSCD1-2表现为菌落无色素沉积、菌丝稀疏、产孢量显著下降、分生孢子无色较小以及致病力明显减弱。结果表明,CcSCD1参与调控多主棒孢霉的黑色素生物合成、营养生长、分生孢子产量及致病力。

假禾谷镰孢是一种土传真菌,其引起的小麦茎基腐病已成为威胁我国小麦生产的重要病害。APSES蛋白是真菌中保守存在的一类转录因子,参与多种细胞生理过程。本研究,我们在假禾谷镰孢中鉴定到StuA同源蛋白FpStuA。qRT-PCR分析发现FpStuA在假禾谷镰孢分生孢子和侵染阶段诱导表达。通过PEG介导的原生质体转化方法获得3个FpStuA基因缺失的突变体。与假禾谷镰孢野生型菌株相比,Δfpstua突变体的生长速度明显减慢,气生菌丝减少;分生孢子的产生比野生型减少70%,且Δfpstua突变体分生孢子变短、分隔减少;Δfpstua突变体对大麦叶片、小麦胚芽鞘和小麦根的致病性均显著降低,脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)合成明显减少。综上结果,转录因子FpStuA对假禾谷镰孢的生长、产孢和致病性都非常重要。

细菌Ⅲ型分泌系统可向寄主植物细胞分泌多种效应蛋白,在丁香假单胞菌猕猴桃致病变种(Psa)侵染猕猴桃致病中发挥关键作用。但是,尚不清楚Psa如何利用这些效应蛋白与寄主互作。Psa的5个生物型群体具有不同种类的效应子,但其中共有的14个效应子可能是参与病菌与寄主亲和互作的关键因子。本研究系统调查了其中HopAZ1的功能。结果显示,HopAZ1广泛分布于丁香假单胞菌的不同类群,在Psa不同生物型群体遗传分化前已经存在,且可能由于在致病中具有重要功能而被纯化选择;HopAZ1在Psa侵染猕猴桃早期被诱导表达,敲除突变体对不同猕猴桃枝条的致病力均显著上升;进而通过构建猕猴桃酵母文库和酵母双杂交筛选,发现HopAZ1可能与猕猴桃抗病相关蛋白Cp1(Acc23383)、PR5(Acc28852)互作。这表明HopAZ1是Psa与猕猴桃互作的重要因子,可能通过与Cp1或PR5互作激发一定程度的抗病反应。这为深入解析HopAZ1的作用机制及猕猴桃抗病基因的挖掘提供了重要依据。

为探明马铃薯疮痂病菌在植株和土壤中的分布情况及种群动态变化特点,利用常规PCR和定量PCR(qPCR)技术对不同环境的马铃薯疮痂病株和田间植株不同生育期的土壤样品进行病原菌的定性定量检测。结果表明,病田、温室盆栽和微型薯苗床中马铃薯疮痂病重度发病植株的根、匍匐茎、块茎、地上茎、叶片等组织样品均可检测到184 bp的疮痂病菌特异性条带,健康植株相应组织均无该条带。病田/温室盆栽/微型薯苗床病株每克不同组织样品疮痂病原菌的孢子当量值分别为:叶片(7.63/8.06/20.49)×10³、地上茎(2.67/4.75/73.35)×10⁴、匍匐茎(56.84/3.78/79.88)×10⁵、块茎(1.67/2.60/43.47)×10⁷、根(2.51/51.79/8.31)×10⁵。在田间病圃中每克土壤疮痂病原菌的孢子当量值变化范围为:自由土(2.12~9.18)×10⁴、根际土(2.31~14.03)×10⁴,在块茎发病期间含量较高。病圃中马铃薯植株生长期间,对植株幼苗期、块茎形成初期、块茎发病期和马铃薯收获期的定量检测结果表明,每克组织疮痂病原菌的孢子当量值约为:叶部(4.62~23.76)×10³、地上茎(6.12~77.08)×10³、匍匐茎(2.75~4.57)×10⁴、根部(1.41~2.36)×10⁵、块茎3.43×10⁴~2.04×10⁷。本研究初步探明了疮痂病菌在马铃薯植株上的分布特征和田间土壤中的种群动态变化,为进一步研究病害的侵染机制和发生规律奠定了基础。

小西葫芦绿斑驳花叶病毒(Zucchini green mottle mosaic virus, ZGMMV)是我国新报道的侵染葫芦科作物的烟草花叶病毒属病毒。从感染病毒的葫芦叶片中分离出ZGMMV,摩擦接种西瓜(Citrullus lanatus)、葫芦(Lagenaria siceraria)、西葫芦(Cucurbita pepo)、南瓜(Cucurbita moschata)、丝瓜(Luffa cylindrica)、黄瓜(Cucumis sativus)、甜瓜(Cucumis melo)、西方烟(Nicotiana occidentalis)、本生烟(Nicotiana benthamiana)和心叶烟(Nicotiana glutinosa),通过症状观察、血清学和分子生物学检测明确症状特点和寄主范围;研究病毒的种子传播,以及整枝打杈和滴灌对于病毒的传播。结果表明:ZGMMV可侵染所有供试植物;叶片症状主要为花叶、斑驳和褪绿斑,西瓜茎蔓出现坏死斑、果实倒瓤,甜瓜果实表皮出现褪绿斑;ZGMMV可通过整枝打杈等农事操作机械传播,也可通过滴灌的水在土壤中传播。该病毒在西瓜、葫芦和甜瓜上可以种传,种传率均约为1%。研究结果有助于制订该病害的综合防控策略。

假禾谷镰孢(Fusarium pseudograminearum,Fp)是我国黄淮麦区小麦茎基腐病(Fusarium crown rot of wheat)的优势病原菌,目前该病害呈不断蔓延和为害加重的趋势。本研究从五月中旬小麦灌浆期至玉米收获期,在河南开封和焦作田间调查采集小麦茎基腐病样,对13份小麦茎秆和小麦残茬上带子囊壳的病样在室内进行单子囊孢子分离培养,获得纯化菌株327个,用形态学和分子生物学方法鉴定均为假禾谷镰孢,交配型MAT1-1和MAT1-2各有164株和163株。对国外报道的有性态诱导方法进行了改进和优化,用不同交配型菌株在Sachs合成固体培养基配以水稻茎节对峙培养,在黑光灯和冷白光灯交替光照及22 ℃条件下,温箱培养60 d左右,KF86×KF73组合在水稻茎节处产生大量子囊壳和成熟子囊孢子。本研究利用假禾谷镰孢子囊孢子后代进行室内有性杂交实验,通过改进诱导子囊壳产生的培养条件,获得高育性菌株,为今后假禾谷镰孢基因功能的有性生殖阶段研究提供材料和方法。

拟禾本科根结线虫(Meloidogyne graminicola)为水稻的重要土传病原,可严重为害水稻。本研究旨在探究水稻中丝裂原活化蛋白激酶5(MPK5)稳态失衡对拟禾本科根结线虫与水稻亲和互作的影响,并初步探讨其机制。首先,通过线虫侵染试验发现,在水稻中超表达和沉默MPK5 引发的MPK5 稳态失衡均可抑制拟禾本科根结线虫与水稻的亲和互作。qRT-PCR 分析结果显示,与水稻野生型不同,在MPK5 超表达和沉默水稻株系中MPK5 均受拟禾本科根结线虫诱导表达。同时,拟禾本科根结线虫可抑制MPK5 超表达株系中几丁质酶的表达,但诱导MPK5 沉默株系中病程相关基因PR5 与PR10 的表达。上述试验结果表明,MPK5 稳态失衡可导致MPK5 响应拟禾本科根结线虫的侵染,且在MPK5 超表达和沉默水稻株系中MPK5 介导水稻产生拟禾本科根结线虫抗性的机制不同。

为建立香梨果萼黑斑病菌链格孢(Alternaria alternata)的原生质体遗传转化体系,本实验以香梨果萼黑斑病菌强致病性菌株LI1为供试材料,研究菌龄、酶系统、酶解时间等对链格孢菌原生质体制备的影响。链格孢菌菌丝在CM液体培养基中培养20 h,以0.7 mol·L^-1 NaCl为稳渗剂,1%裂解酶+1%崩溃酶+1%蜗牛酶的酶液组合下,28 ℃酶解4 h,原生质体制备效率最高。通过PEG/CaCl₂介导法将含有潮霉素B抗性基因和绿色荧光蛋白基因的质粒转入链格孢菌LI1,转化子生长表型及外源基因的PCR鉴定结果表明抗性基因已成功整合到香梨果萼黑斑病菌中。成功建立了香梨果萼黑斑病菌链格孢菌的原生质体遗传转化体系,并成功获得GFP标记菌株,为病原菌侵染定殖过程及致病机制研究奠定了基础。

In order to identify the pathogen of strawberry red leaf root rot in Jiawang District of Xuzhou City, Jiangsu Province, we conducted experiments on isolation and purification, pathogenicity determination, morphological identification and molecular phylogenetic analysis. The results showed that Neopestalotiopsis roase was the pathogen. It is the first report of N. roase infecting strawberry in China.

In September 2019, an unknown rot disease was found on passion fruit of the yellow type that was marketed in Yulin, Guangxi province. The pathogens were isolated by tissue separation method from tissues of diseased passion fruits, and their pathogenicity were verified through Koch′s postulates. According to the morphological characteristics and combined with rDNA-ITS and TEF1-α gene sequences, the pathogen was identified as Lasiodiplodia theobromae. To our knowledge, this is the first repot of postharvest fruit rot in passion fruit caused by L. theobromae.

In November 2019, the typical anthracnose fruits were collected from a papaya orchard in Danzhou City, Hainan Province. The isolate 23 was isolated by tissue isolation method and purified using single-spore isolation approach. According to morphological characteristics and phylogenetic analysis of ITS, GAPDH, TUB, and ACT gene sequences, the pathogen was identified as Colletotrichum okinawense. This is the first report of C. okinawense caused anthracnose on papaya in China mainland.

The pathogen causing blast disease on Zizania latifolia in Dandong city, Liaoning province is identified as Xenopyricularia zizaniicola by the Koch’s postulate, morphological characteristics, and gene sequences analysis on actin, β-tubulin and calmodulin. A representative pathogenic isolate is similar to X. zizaniicola on conidium morphology and is clustered into one clade with X. zizaniicola in phylogenetic tree. Taken together, our findings indicate that X. zizaniicola is the pathogen of blast disease on Z. latifolia in Dandong city.

NF-Y (nuclear factor-Y) family genes play an important role in plant growth, development and response to stress. Related studies on NF-YC subunit genes of maize have not been reported. In this study, 17 NF-YC subunit genes in silicon cloning and bioinformatics methods were divided into three subfamilies, encoding product of CBFD_NFYB_HMF domain by conserved domain analysis. During maize different developmental stages and different tissues, NF-YC subunit genes exhibited significantly different expression levels. The maize NF-YC subunit genes were detected with obvious differences in their expression level under different abiotic stresses and Fusarium Verticillioide infection. Based on qRT-PCR results, the expression levels of NF-YC subunit genes were significantly changed after SA, JA and ET hormones treatments. Collectively, NF-YC subunit genes display conserved functions in maize growth and development as well as resistance to abiotic and biotic stresses, laying a foundation for elucidating the mechanism of NF-YC subunit genes in maize.

在河南省温县地黄(Rehmannia glutinosa)种植园采集茎部感病的地黄植株,从感病部位分离、纯化出4株病原菌。通过对分离菌的形态学观察、致病性检测及ITS、EF1-α、TUB、CAL、HIS多基因核酸序列分析,鉴定其中1株分离菌为扁桃腐皮壳菌(Diaporthe amygdali),为地黄茎部病害的新型致病菌。生物学特性研究表明,最适宜该致病菌生长的为PDA培养基;菌丝生长的最佳温度为25 ℃、最适pH值为6、对光照不敏感;最适碳氮源分别是麦芽糖和蛋白胨。药剂抑菌活性筛选结果表明,选用的10种杀菌剂对D. amygdali生长都有一定的抑制作用,其中500 g·L^-1氟啶胺悬浮剂活性最高,EC₅₀为0.092 5 mg·L^-1。上述结果为D. amygdali引起的地黄茎部病害防治提供了科学依据。

桑脉带相关病毒(Mulberry vein banding associated virus,MVBaV)属于番茄斑萎病毒科(Tospoviridae)正番茄斑萎病毒属(Orthotospovirus)的新成员,是广西桑树病毒病的主要病原病毒。本研究将MVBaV核外壳蛋白(nucleocapsid protein, N protein)基因连接到pET-30a原核表达载体上,获得重组表达载体pET-30a-MVBaV-N并转化大肠杆菌菌株BL21(DE3),经IPTG诱导可表达产生一个含His标签、分子量约36.0 kDa的融合蛋白。用 Ni^{2 +} -NTA树脂纯化融合蛋白,将其免疫日本大耳兔制备多克隆抗体。间接ELISA测定抗体的效价为1∶256 000。Western blot 检测结果显示,该多克隆抗体在稀释倍数1∶1 000时与细菌表达的融合N蛋白及感病桑叶中的N蛋白产生特异性识别,但不与寄主蛋白产生交叉反应,表明具有良好的特异性和较高的灵敏度。将抗体按1∶2 500稀释后进行间接ELISA,可有效检出桑叶中的MVBaV。MVBaV N蛋白抗体的成功研制,为桑脉带病毒病的诊断及MVBaV与寄主相互作用机制的研究提供了重要的试剂。

由禾谷镰刀菌引起的小麦赤霉病是小麦最主要的真菌病害之一。禾谷镰刀菌侵染小麦时分泌脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)真菌毒素,威胁人畜健康。本研究通过对组蛋白乙酰转移酶基因FgHAT1的功能研究,发现该基因编码的蛋白定位于细胞核并调控组蛋白H4的乙酰化。Fghat1敲除突变体在生长发育和致病过程中表现正常,但毒素合成存在显著缺陷。敲除FgHATI导致参与DON毒素合成的TRI基因转录水平降低,突变体产毒相关的细胞分化也表现异常。外源添加cAMP可以有效回复突变体的产毒缺陷,表明FgHat1对毒素的调控与cAMP信号通路有关。研究结果表明组蛋白表观修饰和胞内信号通路之间存在联系,这两者的交叉互作对DON毒素合成的精确调控至关重要。

甘蔗镰孢菌Fusarium sacchari(F. sacchari)引起的甘蔗梢腐病严重影响了甘蔗的产量和质量。解析病原菌的致病机理,对指导甘蔗抗病育种和绿色防控具有重要意义。研究发现NLPs (Nep1-like proteins)类基因在真菌侵染及定殖过程中发挥重要作用。本实验在对梢腐病病原菌基因组测序(尚未公布)基础上,通过BLASTP分析得到甘蔗梢腐病病原菌F. sacchari中4个NLP家族基因Fs_00548、Fs_03159、Fs_06646、Fs_11062。将克隆到的3个基因(Fs_00548、Fs_03159、Fs_11062;Fs_06646未克隆到)构建至PVX载体,利用农杆菌介导的烟草叶片瞬时表达系统,发现只有Fs_00548可以诱导细胞产生与Bax相似的坏死,Fs_03159和Fs_11062则不能。利用酵母信号肽分泌功能验证方法,发现Fs_00548和Fs_03159的信号肽具有分泌活性。并且Fs_00548的信号肽区域对其发挥功能具有重要作用。qRT-PCR结果显示该基因在侵染过程中均有表达,其中72 h表达量最高,是菌丝中该基因表达量的48倍。以上研究结果表明,Fs_00548在病原菌侵染过程中发挥重要作用,研究结果为进一步探究病原菌与甘蔗互作提供参考。

基于菰黑粉菌的全基因组序列,克隆得到了UeRbf1(GenBank登录号:MW375682),该基因的开放阅读框为1 281 bp,无内含子,编码426 个氨基酸,经预测具有3个C₂H₂锌指结构域,提示其具有转录调控功能。进一步在菰黑粉菌中敲除UeRbf1后进行体外生长及侵染试验,发现:在体外培养时,UeRbf1的缺失没有改变菌株的生长速率及单倍体形态,也未改变两个性亲和UeRbf1缺失突变体的融合及菌丝形成能力,但是融合菌丝的丝状生长能力显著减弱,而且在侵染时UeRbf1缺失突变体丧失了菌丝形成及丝状生长能力,人工接种野茭后也无法使其茎部膨大。以上结果表明,UeRbf1是调控菰黑粉菌丝状生长和侵染能力的一个重要因子。另外, UeRbf1缺失突变后,在体外融合及侵染时相关丝状生长和致病力的调控因子Biz1、Clp1、Hdp1和UeKpp6呈下调表达,其中Biz1的下调表达最为显著,在突变体中几乎不表达,说明UeRbf1对菰黑粉菌丝状生长和致病力的影响,可能是通过调控Biz1来实现的。

为明确云南雾水葛表现叶片黄化、花叶等症状的植株是否被菜豆金色黄花叶病毒属病毒侵染,本研究通过PCR扩增、克隆测序及核苷酸序列特征分析,确定样品中病原种类及其系统进化关系。结果显示,该病样中检测到雾水葛金色花叶病毒(pouzolzia golden mosaic virus,PouGMV),该分离物全基因组具有典型的菜豆金色花叶病毒属单组分病毒结构特征,与来自越南的Vietam分离物(KC857508)亲缘关系最近,相似性最高达94.6%,与PouGMV其他分离物亲缘关系相对较远,相似性在88.9%~93.2%之间。病毒alpha卫星分子检测及分析显示,该样品中检测到的alpha卫星分子,其全长核苷酸序列与云南番茄黄化曲叶alpha卫星(tomato yellow leaf curl Yunnan alphasatellite,TYLCYnA)相似性最高,达到92.3%。研究结果表明云南雾水葛中分离到PouGMV,且异源伴随TYLCYnA卫星分子。这是雾水葛金色花叶病毒伴随alpha卫星分子侵染雾水葛的首次报道。

象耳豆根结线虫是近年在我国发现的一种扩散迅速、寄主广泛、致病性强的根结线虫。为探究象耳豆根结线虫的强致病性原因,本研究用象耳豆根结线虫和南方根结线虫分别接种抗线虫番茄品种VFNT和感病番茄品种Rutgers,30 d后象耳豆根结线虫对VFNT和Rutgers的累计侵入率分别为14.1%和19.2%、虫瘿率为62.5%和81.6%,而此时南方根结线虫累计侵入率为0%和18.8%、虫瘿率为0%和68.5%,象耳豆根结线虫的侵染力和致病力显著强于南方根结线虫;通过侵染抗病番茄品种VFNT的病理切片以及根尖侵染早期胼胝质、活性氧染色发现象耳豆根结线虫的侵染不会激活Mi-1基因诱导的特异性抗性,在侵染早期南方根结线虫引起的胼胝质沉积量在72 h最大,是象耳豆根结线虫的2.0倍;体外H₂O₂应激测试发现,H₂O₂浓度为10～80 μmol·L^-1象耳豆根结线虫对H₂O₂的耐受性显著强于南方根结线虫。象耳豆根结线虫具有强致病性的原因可能是:具有更强的侵染力和活性氧耐受力;侵染不会激活Mi-1基因诱导的特异性抗性且侵染引起的胼胝质的积累量较低。

丙环唑是一种具有广谱活性的三唑类杀菌剂。本研究首次采用菌丝生长速率法建立了浙江省绍兴市、江苏省淮安市和黑龙江省尚志市不同地区的80株水稻恶苗病原菌(Fusarium fujikuroi)对丙环唑的敏感性基线,测定了丙环唑对水稻恶苗病菌的生理影响和对水稻的安全性。结果表明: 丙环唑对水稻恶苗病菌菌丝生长的有效抑制中浓度(EC₅₀值)范围在0.029 8~0.211 0 μg·mL^-1,EC₅₀平均值为(0.106 7 ± 0.004 4) μg·mL^-1。水稻恶苗病菌经0.1 μg·mL^-1(EC₅₀平均值)或3 μg·mL^-1(EC₉₀平均值)丙环唑处理后,分生孢子产量显著降低,细胞膜通透性显著升高;3 μg·mL^-1丙环唑不影响水稻恶苗病菌细胞核的分布与定位,但可以使细胞壁缢缩,菌丝顶端膨大,破坏水稻恶苗病菌细胞膜和细胞器。丙环唑浓度为不超过200 μg·mL^-1时,对水稻种子发芽率和株高无显著影响,同时可显著增加水稻鲜重;当浓度为500 μg·mL^-1时,对水稻种子发芽率、株高和鲜重均无显著性影响;当浓度达到1 000 μg·mL^-1时,发芽率显著降低但株高和鲜重无显著性差异;水稻种子发芽长度随丙环唑浓度升高而降低。本研究明确了丙环唑对水稻恶苗病菌的生物活性和对水稻的安全性,为丙环唑防治水稻恶苗病提供了指导,并进一步加深对丙环唑作用机理的认识。

Ilyonectria属真菌是引起西洋参锈腐病的主要病原菌,每年给西洋参生产造成重要经济损失。本文选取分离自我国吉林省及山东省栽培的西洋参的I. mors-panacis、I. robusta、I. vredehoekensis及I. communis 4种病原菌,通过平板培养,测定它们在不同培养基、温度、碳源、氮源和光照条件下菌丝生长和产孢量;采用生长速率法测定对6种常用杀菌剂的敏感性。生物学试验结果表明:Czapek培养基为Ilyonectria spp.菌丝生长的最适培养基,PDA、OA和CMA培养基有利于产孢;菌丝生长最适碳源和氮源分别是可溶性淀粉和硝态氮,不同碳源对各菌株产孢的作用不同,最适产孢氮源为硫酸铵;I. vredehoekensis最适生长温度为25 ℃,I. robusta为20～25 ℃,其他2种菌则为20 ℃,产孢最适温度范围为15～20 ℃;黑暗条件适宜供试菌的生长,全光照有利于I. mors-panacis和I. robusta产孢,但不利于I. vredehoekensis和I. communis产孢。药剂试验结果表明:同一杀菌剂对4种病菌的作用存在差异,在供试的6种杀菌剂中,4种病菌对多菌灵最为敏感(EC₅₀<0.5 μg·mL^-1),其次是戊唑醇(EC₅₀<15 μg·mL^-1),恶霉灵的抑制效果最差(EC₅₀>960 μg·mL^-1)。上述研究结果为了解西洋参锈腐病菌Ilyonectria的环境适应性及防治策略提供了有益参考。

为发现绿色安全的水稻白叶枯病天然生物防治微生物,本研究从植物根际土壤中分离获得165株放线菌。利用共培养法和牛津杯法,筛选获得了5株拮抗水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae, Xoo)的放线菌,其中拮抗能力最强的是Sl-10菌株,发酵液抑菌圈直径为62.1 mm ± 1.5 mm。根据形态特征、生理生化实验、16S rDNA序列和系统发育分析,鉴定Sl-10菌株为淡紫灰链霉菌(Streptomyces lavendulae)。Sl-10菌株发酵液对大豆斑点病菌(Pseudomonas syringae pv. glycinea)、烟草野火病菌(P. syringae pv. tabaci)、油菜黑腐病菌(X. campestris pv. campestris)、大豆斑疹病菌(X. axonopodis pv. glycines)、水稻条斑病菌(X. oryzae pv. oryzicola)、烟草青枯病菌(Ralstonia solanacearum)和番茄叶斑病菌(P. syringae pv. tomato)7种植物病原细菌均有拮抗作用。Sl-10菌株发酵液具有较好的耐光、耐酸碱和热稳定性。SDS-PAGE电泳结果显示,Sl-10菌株可抑制Xoo的蛋白质合成。4个品种水稻(甬优15、湘两优900、嘉丰2号和甬优1540)喷施Sl-10菌株发酵液,水稻白叶枯病的病斑抑制率达到82.27%~91.78%。研究结果显示,淡紫灰链霉菌Sl-10菌株具有较好的水稻白叶枯病生物防治潜能。

采用单因素试验和响应面分析等方法优化解淀粉芽胞杆菌ZF57的发酵工艺。得到解淀粉芽胞杆菌ZF57发酵的最优条件为山梨醇10 g·L^-1、棉籽饼粉17 g·L^-1、NaH₂PO₄ 0.5 g·L^-1、Na₂HPO₄ 0.4 g·L^-1,初始pH 7.0、装液量80 mL/250mL三角瓶、接种量2.1%、培养温度30℃、转速180 r·min^-1、发酵时间32 h,此时含菌量达到3.8×10⁸ CFU·mL^-1,较优化前提高了80%。明确了解淀粉芽胞杆菌微粉剂的最佳配方为解淀粉芽胞杆菌母粉50%,白炭黑10%,分散剂木质素磺酸钠1%,表面活性剂十二烷基硫酸钠4%,保护剂羧甲基纤维素钠1%,硅藻土补足至100%。该制剂含菌量为3.26×10⁹ CFU·mL^-1,平均粒径8.31 μm,分散指数98.16%,浮游性指数85.37,含水率1.42%,坡度角68°,各项检测结果均符合标准。解淀粉芽胞杆菌ZF57微粉剂对黄瓜棒孢叶斑病的田间防治效果高达97.12%。

设施番茄灰霉病发生频繁,易产生抗药性,利用微生物杀菌剂防治番茄灰霉病是切实可行且对环境友好的措施之一。本研究通过抑菌活性测定和田间棚室试验,获得一株有效防治番茄灰霉病的生防细菌HMB19198,通过16S rDNA联合gyrA、gyrB、rpoB和rpoC等看家基因序列比对将菌株HMB19198鉴定为枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)。对峙培养结果表明,菌株HMB19198的脂肽提取物对灰霉菌表现较强的抑菌活性,通过色谱分离技术结合质谱分析,证明菌株HMB19198主要产生脂肽类抗生素丰原素(fengycin)和表面活性素surfactin,其中fengycin包含fengycin A(C15-C18)和fengycin C(C19-C20)两种同系物。抑菌活性测定表明,fengycin对灰霉菌表现较强的抑菌活性,显微观察发现,fengycin处理后造成灰霉菌菌丝畸形。通过对菌株HMB19198全基因组序列进行分析,获得fengycin合成酶基因簇,从基因水平证明菌株HMB19198可以产生fengycin。

为研究复合微生物菌肥对再植苹果幼树的影响,从再植土壤酶活性、真菌群落结构和功能的方面分析,探究复合微生物菌肥的作用机理。本研究设置了KMM和对照CK两个处理,再植苹果树于春秋两次分别施用复合微生物菌肥(KMM)和有机肥(CK)。通过土壤常规农业化学分析法和Illumma MiSeq高通量测序技术,系统研究了两个处理再植苹果树的生长、根围土壤酶活性以及真菌群落结构和功能的变化。试验结果表明,施用复合微生物菌肥显著提高了再植苹果幼树株高、干径、叶绿素、分枝个数和分枝长度;提高再植土壤酶活性(中性磷酸酶、脲酶、蔗糖酶和过氧化氢酶);降低再植土壤真菌群落丰富度,改变真菌群落结构。相对丰度高于1%的优势真菌属中有21个菌属与再植果树的5项生长参数具有相关性,并且在不同分类水平上具有一定的差异,缝壳菌属(Lophiostoma)、织球壳菌属(Plectosphaerella)、赤壳菌属(Nectria)和维希尼克氏属(Vishniacozyma)显著增加,丝孢菌属(Anguillospora)和假丝酵母菌属(Pseudeurotium) 显著降低。通过对测序片段功能水平的分析,在二级功能水平上显著降低了真菌群落氨基酸、核苷和核苷酸的生物合成、电子转移、发酵、呼吸、CTP生物合成嘧啶脱氧核糖核酸功能序列的丰度值,共6种功能类群均与土壤酶活性呈负相关。施用复合微生物菌肥,改变了真菌群落结构,减弱真菌群落相关代谢的功能,提高土壤酶活性,促进再植苹果幼树的生长。

为建立麦根腐平脐蠕孢简单快速的分子检测方法,基于环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)技术,以核糖体DNA的ITS为靶标序列,设计和筛选出一组麦根腐平脐蠕孢的特异性引物,成功开发可快速准确检测麦根腐平脐蠕孢的LAMP方法。甜菜碱作用测试显示LAMP体系中是否添加甜菜碱对扩增结果无明显影响;特异性测试显示该LAMP方法能够从14种植物病原菌中特异地检测出麦根腐平脐蠕孢;灵敏度测试显示该LAMP方法的检测极限为10^-3 ng·μL^-1,是常规PCR检测方法灵敏度的100倍;通用性测试显示该LAMP方法能够准确检测洛阳、安阳、开封和邯郸等不同地理来源的麦根腐平脐蠕孢菌株;发病组织检测显示该LAMP方法能够准确地从人工接种的小麦发病组织中检测出麦根腐平脐蠕孢,检出时间为侵染12 h及以上。这些研究结果表明所建立的麦根腐平脐蠕孢LAMP检测方法特异性好、灵敏度高、适用性强,可用于小麦根腐病的早期快速诊断。

From 2018 to 2019, we carried out the occurrence and pathogen identification of strawberry root rot in Beijing. Samples were collected for tissue isolation and purification, and three single-spore strains (JZB3310013, JZB3310014 and JZB3310015) were obtained. According to the morphological characteristics, three strains were primarily identified as Dactylonectria sp.. The phylogenetic tree showed that JZB3310013 and JZB3310014 were clustered with Dactylonectria alcacerensis (CBS 129087), and JZB3310015 was clustered with D. torresensis (CBS 129086). Based on both morphological characters described and phylogenetic analysis, JZB3310013 and JZB3310014 were identified as D. alcacerensis, and JZB3310015 were identified as D. torresensis. The assay of Koch’s postulates confirmed that both D. alcacerensis and D. torresensis were the pathogen of this disease. To our knowledge, this is the first report of D. alcacerensis causing root rot on strawberry worldwide, and D. torresensis causing root rot on strawberry in China.

During August-October 2020,a new leaf Fusarium wilt of welsh onion was found in Moxi Welsh Onion Planting Base in Shaanxi Province. Small pieces of symptomatic tissue were taken from welsh onion leaves using a tissue isolation method. Based on morphological characteristics, and phylogenetic analyses of ITS and TEF gene sequences, the pathogens were identified as Fusarium equiseti and F. proliferatum. To our knowledge, this is the first report of F. equiseti and F. proliferatum causing Fusarium wilt disease on welsh onion leaves in China as well as worldwide.

In order to explore the pathogenic bacteria of walnut black spot in Luoyang, a field survey was carried out in Luoyang walnut orchard in 2020, typical disease samples were collected, and the pathogenic bacteria were isolated by tissue separation method. After purification and culture, the pathogens were connected to healthy leaves by acupuncture method, and the pathogenicity was tested and Koch′s rule was verified. The isolated strain YSYB was identified by morphological characteristics, physiological and biological identification, and the results showed that the strain YSYB was very similar to Pantoea. Using the total DNA of the strain as a template, the 16S rDNA universal primer was used for PCR amplification. Agarose gel electrophoresis showed a fragment of about 1 500 bp in length, and sequencing results showed that the amplified 16S rDNA fragment was 1 450 bp in length. The results showed that the 16S rDNA sequence of strain YSYB was 100% similar to Pantoea agglomerans by comparison with the known sequence in GenBank, and the phylogenetic tree was clustered into the same branch. The results showed that the pathogen was P. agglomerans.

In 2018, some Impatiens balsamina plants exhibiting viral symptoms like chlorosis and mosaic were observed in the herb garden of Changchun University of Chinese Medicine in Changchun city, Jilin province. Systemic mosaic symptoms of Chenopodium amaranticolor and Nicotiana glutinosa mechanically inoculated with the sap of the diseased I. balsamina leaves were found. To further identify the pathogen of the diseased I. balsamina, high-throughput siRNA sequencing was performed and further verified by RT-PCR. The results showed that the diseased I. balsamina plants were mainly infected by alfalfa mosaic virus (AMV). The sequences of p1, p2, mp and cp genes of AMV I. balsamina (AMV-Ib) isolate were obtained by RT-PCR. Phylogenetic analysis based on the nucleotide sequence of the coat protein genes of AMV-Ib isolate showed that it is closely related to the subgroup I of AMV isolates. To our knowledge, this is the world’s first report of natural AMV infection on I. balsamina.

In August of 2019, the leaves of Rehmannia glutinosa exhibiting chlorotic patches, mosaic, and irregular yellowing symptoms were observed in Chinese planting area located in WenXian Country of Henan Province. Total RNA was extracted from R. glutinosa samples that were suspected to be infected by viruses, and the siRNAs were obtained. After siRNA library construction, high-throughput sequencing was performed. The obtained reads were assembled by Velvet Software and analyzed by BLASTn in NCBI. The deep sequencing results showed that these samples were mainly infected with cucurbit chlorotic yellows virus (CCYV). Furthermore, RT-PCR and ELISA analyses showed that CCYV could naturally infect R. glutinosa. The coat protein (CP) coding sequence of CCYV R. glutinosa isolate was cloned and sequenced. The genetic variation was analyzed by constructing the phylogenetic tree based on the CP gene sequences. This study enriched the genetic information of CCYV population and provided a basis for the monitoring and further research on CCYV infecting R. glutinosa.

近年来,甘肃省白银市靖远县的一些砂田西瓜中出现了严重的叶疫病,严重田块病株率超过70%。2018年7月,从靖远县高湾乡罹病西瓜叶片上分离得到拟多隔孢属Stagonosporopsis真菌,病叶检出率达100%。采用离体叶片和植株接种法评价单孢分离菌株XG-3对西瓜和甜瓜的致病性,所有接种处理在24 h内均发病显症而对照未发病,其中发病叶片原接种菌的检出率为100%。菌株XG-3在PDA和OA平板培养基上20和25 ℃培养20 d,未见产孢。在自然感病的西瓜叶片上观察到少量分生孢子器,在人工接种发病的西瓜和甜瓜茎、叶上产生大量分生孢子器和分生孢子:分生孢子器球形至亚球形,大小为(82.4~243.3) μm×(82.4~188.4)μm,分生孢子器具1~2个孔口,孔口直径15.7~27.5 μm;分生孢子无色,0~3个隔膜,杆状、柱状、长椭圆形、花生形及不规则形,直或稍弯曲,分隔处不缢缩或缢缩,大小为(5.2~28.3)μm×(2.2~6.0)μm,分生孢子形态和大小依基质和环境条件的不同而有较大差异。BLASTn分析结果显示,菌株XG-3(GenBank登录号:MW282128)的rDNA-ITS序列与瓜拟多隔孢Sta. cucurbitacearum分离物287ITS(GenBank登录号:AY293804.1)的序列相似性达99.80%。在基于rDNA-ITS构建的系统发育树中,菌株XG-3与Sta. cucurbitacearum聚为一组,与西瓜拟多隔孢Sta. citrulli和木瓜拟多隔孢Sta. caricae区分开来。依据病菌形态学和分子生物学特征,将菌株XG-3鉴定为瓜拟多隔孢Sta. cucurbitacearum [Basionym: Sphaeria cucurbitacearum]。

细胞自噬(Autophagy)是一种真核生物中高度保守的胞内物质降解和循环再利用的生理过程,其调控细胞动态平衡、压力适应和细胞程序性死亡,与植物病原真菌生长发育、孢子形成、侵染等一系列过程密切相关。荔枝霜疫霉(Peronophythora litchii)侵染引起的荔枝霜疫病严重危害荔枝生产及采后贮藏。本研究利用模式物种中已知的自噬相关蛋白,采用同源比对的方法在荔枝霜疫霉基因组数据库中鉴定到19个同源蛋白,分属16种蛋白类型。分析基因结构和蛋白保守功能域,发现荔枝霜疫霉自噬相关基因均具有内含子,且数目差异明显;所鉴定候选蛋白都具有相应分组的保守功能域,而PlATG1a在C端具有2个额外的ATG11功能域,PlATG11则在其N端包含1个APG17功能域。进一步对具有核心功能且多成员的自噬相关蛋白ATG1、ATG6、ATG8和ATG18进行系统进化和序列模块分析发现,这些蛋白在不同物种之间十分保守,但是其同源蛋白间存在分化。通过转录组数据分析和qRT-PCR验证结果显示,荔枝霜疫霉中自噬相关基因在生长发育和侵染阶段均有表达,与菌丝阶段相比,PlATG1a、 PlATG2、PlATG3、PlATG6a、PlATG8、PlATG18a基因在游动孢子阶段特异上调表达,其中PlATG8最为显著;PlVPS34在孢子囊阶段特异诱导表达,PlATG1b、PlATG12、PlATG17在孢子囊与游动孢子阶段上调表达但是在侵染阶段下调表达;PlATG6b、PlATG9、PlATG10、PlATG13、PlATG14及PlVPS15基因在生长发育和侵染阶段均表现出不同程度的上调表达,PlATG7、PlATG11、PlATG18b 则在侵染阶段显著下调表达。结果表明,细胞自噬可能参与调控荔枝霜疫霉的生长发育及致病过程。

香蕉枯萎病是由尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporum f. sp. cubense,Foc)引起的香蕉毁灭性土传病害,其中 4号生理小种(Foc4)能感染几乎所有的香蕉品系,危害最严重。SMART在线软件分析myosin-1基因具有肌球蛋白马达蛋白(myosin motor domain, MMD),肌动蛋白尾结构TH1(myosin tail)和 Src家族同源结构域SH3(src homology domain 3),与禾谷镰刀菌中氰烯菌酯靶标基因myosin-5具高度的蛋白同源性,相似性高达83%。利用Split-marker基因重组技术获得Foc4的myosin-1基因敲除突变体,Δmyosin-1突变株丧失了对氰烯菌酯的敏感性,菌丝生长缓慢,产孢量减少且孢子畸形,对香蕉致病力严重下降,证实myosin-1是氰烯菌酯在Foc4中的作用靶标基因。外施靶向myosin-1体外转录的dsRNA,能抑制菌丝的生长,降低菌丝活性;菌丝膨胀扭曲分枝增多,出现典型的球状结构,与氰烯菌酯处理后的表型一致。在盆栽活体人工接种实验中,体外施用dsRNA可以明显抑制枯萎病外部症状的发展,推迟发病时间,赋予寄主抗性,结果说明体外施用dsRNA可以作为新型杀菌剂防治香蕉枯萎病。综上,myosin-1基因作为氰烯菌酯在Foc4中的靶标基因具有高度的序列保守,在调控菌丝生长发育,产孢以及致病力等方面发挥重要作用,而外施dsRNA具有防治香蕉枯萎菌的巨大潜力。

III型分泌系统(T3SS)是植物病原细菌的主要致病系统,负责分泌和转运效应蛋白。T3SS结构的形成需要跨越由肽聚糖包被的细菌细胞壁周质层。HrpH是丁香假单胞菌T3SS特化的裂解性转糖基酶。本研究通过原核表达纯化了HrpH及其相关结构域蛋白,发现HrpH具有结合肽聚糖的能力,其中SLT结构域是肽聚糖结合的关键功能域,第148位的谷氨酸是结合的关键位点。进一步研究发现HrpH能够抑制丁香假单胞菌番茄致病变种DC3000(Pst DC3000)的生长,透射电镜显示,HrpH蛋白处理Pst DC3000使其细胞壁的完整性受损。以上研究结果表明HrpH通过裂解细胞壁、结合肽聚糖从而协助T3SS穿透细菌细胞壁形成超分子复合体。

假禾谷镰孢(Fusarium pseudograminearum, Fp)是引起小麦茎基腐病的优势病原菌,但关于该病原菌致病机理的研究报道很少。三角状五肽重复蛋白(Pentatricopeptide repeat protein,Ppr)为一类核编码的RNA结合蛋白,通过结合特定的RNA序列调控靶标基因RNA的成熟过程,参与线粒体基因组转录和翻译。Ppr蛋白在植物、动物(包括人)及酵母中有一些研究报道,但在丝状真菌特别是植物病原真菌中鲜见报道。为了明确假禾谷镰孢中PPR基因家族的特征,本研究通过全基因组Blastp分析,共鉴定出8个PPR候选基因序列FpPPR1~FpPPR8,主要分布在1号、3号、4号染色体上,基本不含有内含子。理化性质与功能预测显示,Ppr为亲水性蛋白,氨基酸长度510~1 353 aa,分子量59.09~152.23 kDa,等电点为5.23~9.69,其中FpPpr3和FpPpr7为稳定蛋白,其他6个蛋白为不稳定蛋白。亚细胞定位预测显示,Ppr蛋白主要位于线粒体。FpPpr1、FpPpr3、FpPpr5、FpPpr6和FpPpr7的3D结构预测形成明显的超螺旋结构。在假禾谷镰孢营养阶段和侵染过程的转录组数据中分析了8个基因表达模式,通过qRT-PCR进行验证,FpPPR1、FpPPR3、FpPPR5在菌丝阶段高表达,FpPPR1、FpPPR5在侵染后期显著下调。本研究结果为进一步研究假禾谷镰孢中PPRs基因的生物学功能奠定基础。