由烟草疫霉(Phytophthora nicotianae)引发的烟草黑胫病是烟草产区发生的一种主要土传病害,近年来常与镰刀菌根腐病复合发生,给黑胫病菌的分离和纯化带来了极大困难。为了从这两种病害复合侵染的烟草样品中高效分离获得烟草黑胫病菌,本研究开发了针对该病菌的新型选择性培养基。选择适当剂量精甲·咯菌晴、恶霉灵、苯醚甲环唑、氟啶胺、抑霉唑和戊唑醇分别加入燕麦琼脂培养基中,测定不同含药培养基对茄病镰刀菌(Fusarium solani)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、烟草黑胫病菌的抑制作用以及针对不同病菌复合侵染的烟草样品中黑胫病菌的分离率,发现50 μg·mL^-1抑霉唑、20 μg·mL^-1戊唑醇均能有效抑制茄病镰刀菌和尖孢镰刀菌的菌丝生长,但对烟草黑胫病菌的抑制作用较小。从田间采集黑胫病菌和根腐病菌复合侵染的烟草病样,使用含有抑霉唑或戊唑醇的培养基分离病原菌,结果烟草黑胫病菌的分离率高达80%~90%,而使用普通燕麦琼脂培养基时烟草黑胫病菌的分离率仅为35%。因此,使用含有50 μg·mL^-1抑霉唑或20 μg·mL^-1戊唑醇的选择性培养基均能从黑胫病和根腐病复合发生的烟草病株中高效分离获得烟草黑胫病菌。

马铃薯(Solanum tuberosum L.)为粮菜兼用作物,是我国四大主粮之一。近年,由Ralstonia solanacearum引起的植株青枯及块茎腐烂,在我国西南马铃薯主产区普遍发生,严重影响马铃薯的产量及品质。病原菌的早期诊断是建立病害综合防控体系的重要环节。因此,亟需建立一种快速、准确和灵敏度高的田间检测方法。本研究根据GenBank中fliC全长基因序列,设计特异性重组酶聚合酶扩增(Recombinase polymerase amplification, RPA)引物和CRISPR-Cas12a crRNA,建立RPA与CRISPR-Cas12a相结合的等温扩增方法,并通过荧光和试纸条两种可视化方法进行结果判定。研究通过优化RPA/CRISPR-Cas12a 的反应条件,发现在 37 ℃恒温条件下,以R. solanacearum侵染后处于潜育期的种薯为研究对象,分别进行荧光检测及试纸条检测,两种方法均可特异性检测出R. solanacearum,而对其他马铃薯主要病原及土壤常见菌株均无有效扩增。此外,研究发现荧光法检测极限可达10 fg·μL^-1,试纸条检测极限为100 fg·μL^-1。研究进一步利用试纸条法开展现场快速检测,发现该方法操作简便且无需昂贵的实验设备,适合田间即时诊断。通过对不同批次种薯的现场检测, RPA/CRISPR-Cas12a试纸条法能够准确检测出被R. solanacearum潜伏侵染的种薯。本研究所开发的RPA/CRISPR-Cas12a方法可用于种薯感染R. solanacearum的早期检测, 有利于马铃薯病害的早期预防及病害诊断。

为快速准确检测菜豆细菌性萎蔫病菌(Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens, Cff),根据GenBank中Cff的序列设计特异性探针Cff-P,并首次建立了Cff探针法实时荧光定量PCR(TaqMan quantitative real-time PCR,qPCR)检测方法。经验证,探针Cff-P能扩增供试的34株Cff菌株,其他66株供试的非Cff菌株以及空白对照均为阴性,不同稀释度菌体DNA的扩增结果显示,该方法的检测灵敏度为50 fg·μL^-1菌体DNA。140个豆类种子样品的检测结果表明该检测方法可用于豆类种子样品中Cff的快速检测。本研究建立的TaqMan探针法实时荧光定量PCR检测方法,为我国农业部门和进境口岸Cff快速筛查提供了技术支持。

山药种植过程中普遍受到多种病毒的复合侵染,严重影响其产量和品质。为了实现对多种山药病毒的高效、快速检测,本研究建立了一种可以同时检测油菜花叶病毒(youcai mosaic virus, YoMV)、日本山药花叶病毒(Japanese yam mosaic virus, JYMV)、蚕豆萎蔫病毒-2(broad bean wilt virus-2,BBWV-2)、山药潜隐病毒(yam latent virus, YLV)和山药黄斑花叶病毒(yam yellow spot mosaic virus, YYSMV)的多重RT-PCR检测方法,5种病毒扩增目的条带大小分别为:504、614、750、1 030和1 207 bp,最佳的退火温度为55 ℃,各病毒多重PCR添加特引物浓度分别为YoMV F/R 0.08 μmol·L^-1、JYMV F/R 0.04 μmol·L^-1、BBWV-2 F/R 0.16 μmol·L^-1、YLV F/R 0.32 μmol·L^-1、YYSMV F/R 0.24 μmol·L^-1,检测灵敏度为8.11×10⁵个拷贝·μL^-1。本检测方法可以高效、准确地检测山药上的5种病毒,极大的提高了检测效率,为山药病毒病的检测提供了技术支撑。

新德里番茄曲叶病毒(tomato leaf curl New Delhi virus,ToLCNDV)和番茄黄化曲叶病毒(tomato yellow leaf curl virus,TYLCV)均由烟粉虱传播,在自然条件下能复合侵染番茄,危害巨大。因此,建立一种准确、快速、能够同时检测这两种病毒的检测方法,对于快速诊断和田间监测具有重要的意义。本研究基于重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)技术,开发了一种靶向ToLCNDV和TYLCV的双重RPA检测方法,其灵敏度为10⁴ copies·mL^-1,反应仅需25 min,可用于植物和烟粉虱中ToLCNDV和TYLCV的检测,是鉴定和监测这两种病毒便捷和灵敏的新方法。

根据烟草轻型绿花叶病毒(tobacco mild green mosaic virus, TMGMV)的外壳蛋白(coat protein,CP)基因设计引物和探针,将重组酶聚合酶扩增技术(recombinase polymerase amplification,RPA)和侧流层析试纸条(lateral flow dipstick,LFD)相结合,建立了一种TMGMV的快速检测方法,对该检测方法中的反应时间、反应温度进行了优化,并检测了该方法的特异性和灵敏度。试验结果表明,RT-RPA-LFD检测体系的最佳反应条件是温度37℃、反应时间30 min。该方法能够特异性检测TMGMV,与其它病毒无交叉反应,对TMGMV CP 的最低检测限度为1.65×10⁰拷贝·μL^-1,比普通 PCR 检测灵敏度高10倍。该方法灵敏度高、特异性强,能够用于田间地黄样品中TMGMV的检测,便于基层科研单位对该病毒的准确检测和诊断。

由枣疯病植原体(Candidatus Phytoplasma ziziphi)侵染引起的枣疯病严重威胁枣产业健康发展。病害诊断和病原检测是枣疯病科学防控的关键环节,其实施依赖于高效灵敏的枣疯病植原体分子检测技术。本研究基于环介导等温扩增(LAMP)技术及其产物不同检测方式,建立了LAMP-凝胶电泳、LAMP-HNB/SYBR染料显色以及环介导等温扩增联合横向流动试纸条(LAMP-LFD)等三种Ca. Phytoplasma ziziphi可视化检测方法。结果显示,建立的LAMP检测方法对Ca. Phytoplasma ziziphi具有高度特异性,能够检测出Ca. Phytoplasma ziziphi DNA最低浓度为20 pg·μL^-1,较常规PCR灵敏100倍。三种检测方法适应于常规实验室、基层植保站等不同应用场景的Ca. Phytoplasma ziziphi可视化检测,对供试14份田间枣树样品中枣植原体的检出率为100%,明显高于常规PCR。本研究建立的LAMP 方法能够快速、特异、灵敏地检测Ca. Phytoplasma ziziphi,同时可免除高昂的仪器投入,适合田间推广使用,对枣疯病的早期诊断和监测预警具有重要意义。

杜鹃花枯萎病菌(Ovulinia azaleae Weiss)是我国进境植物检疫性有害生物,病菌引起的杜鹃花枯萎病对我国杜鹃花产业可造成较大危害。为快速检测该病菌,根据O. azaleae ITS序列,基于酶介导双重指数扩增技术,设计并筛选到引物和探针组合。灵敏度测试结果表明,其最低检测限量为20 μL反应体系中总DNA含量1.00 pg。样品检测结果表明,该方法操作简便、耗时较短、特异性强,适用于口岸进出境植物材料中O. azaleae的检测。

为快速检测烟草轻型绿花叶病毒(tobacco mild green mosaic virus, TMGMV),本文根据TMGMV外壳蛋白(coat protein,CP)基因的保守序列设计了3组RT-LAMP引物进行筛选确定最佳引物组合;采用单一变量法对反应温度和反应时间进行优化,并将RT-PCR和RT-LAMP进行对比实验,验证优化后特异性检测、灵敏度比较及田间应用的实际性,建立了TMGMV RT-LAMP快速检测技术体系。结果表明:RT-LAMP最适反应条件为在65 ℃恒温扩增60 min,优化后的RT-LAMP灵敏度是常规RT-PCR的1 000倍,可检测到模板的最低浓度为1.65×10^-2拷贝·μL^-1,检测过程中与其他相关病毒无交叉反应。对60份地黄样品的检测结果表明,RT-LAMP方法的检出率(100%)高于RT-PCR检出率(83.3%)。因此本研究建立的RT-LAMP检测技术可用于TMGMV的快速检测。

植物病害标本在植物病害的研究和教学中具有重要意义。常规标本制作方法制作的植物病害标本易变色、损坏,缺乏立体感,且不宜长期保存。本研究结合真空冻干技术和水晶滴胶工艺,制作了苹果锈病病菌冬孢子角的胶质状态和萌发状态的标本。此方法成本低,制作的是三维立体的植物病害标本,易于全方位观察,精致美观,即使长期保存也能同时保持植物样品和病原物原有的形态和颜色特征,为植物病理学实验课程或相关教学环节提供了植物病害标本的制作方法。

可可毛色二孢(Lasiodiplodia theobromae)是葡萄溃疡病菌中的优势致病菌。但是由于L. theobromae的遗传转化体系的不成熟和多核完整基因组序列现象的存在,一直未能获得L. theobromae的纯合突变体。L. theobromae纯合突变体的构建为后续L. theobromae的基因功能研究奠定基础。本研究以L. theobromaeLtAGO1基因为敲除对象,通过Double-joint PCR技术将LtAGO1基因上下游同源臂序列构建到PKOV21的敲除载体上;对L. theobromae菌株CSS-01s进行酶解法原生质体制备;同时用聚乙二醇介导的原生质体转化法将敲除载体转入L. theobromae原生质体中;最后通过PCR方法对LtAGO1突变体纯合菌株进行筛选。与传统同源重组方法构建丝状真菌纯合敲除突变体相比,本研究改变了转化子筛选的过程。在前期用潮霉素筛选获得LtAGO1杂合突变体的基础上,通过挑取杂合突变体菌丝尖端重新制备原生质体,将原生质体稀释浓度后进行再一次潮霉素筛选。与常规同源重组方法相比,提高了获得L. theobromae纯合突变体的概率,从无法获得纯合突变体提高到纯合突变体获得率为45%。同时LtAGO1突变体菌株与野生型相比,生长速率加快,致病力显著增强。本研究构建的纯合突变体为研究L. theobromae基因功能奠定基础。

德里腐霉(Pythium deliense)是一种重要的植物病原卵菌,可侵染烟草、大豆、绿豆等多种作物造成严重危害。本研究基于环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术,以编码3-磷酸甘油酸激酶(3-phosphoglyceric phosphokinase,Pgk)的基因作为靶标,设计并筛选了4条特异性强、灵敏度高的LAMP引物和1条环引物。进一步通过特异性和灵敏度检测,以及人工模拟接种和田间发病组织检测试验,建立了P. deliense的LAMP检测体系(Pgk-Pd-LAMP)。该检测体系中含有羟基萘酚蓝(HNB),经63 ℃等温扩增60 min后,根据染料颜色变化即可判定扩增结果。在特异性检测试验中,仅P. deliense扩增后呈天蓝色的阳性反应,而其它供试的卵菌和真菌菌株扩增后均呈紫色的阴性反应。该方法对于P. deliense基因组DNA的最低检测限为100 pg·μL^-1;在卵孢子污染的土壤中,检测下限为每0.25 g土壤中10个卵孢子。应用该检测体系可实现P. deliense的特异性检测及其所致病害的快速诊断。

由禾谷炭疽菌(Colletotrichum cereale)引起的燕麦炭疽病是影响燕麦产量和品质的主要病害,建立准确、快速的检测方法是及时监测和防治燕麦炭疽病的关键。本研究基于ITS区序列设计特异性引物ITS-2F/ITS-2R,将其与通用引物ITS1/ITS4组合成巢式PCR引物组,在优化的反应条件和反应体系下可稳定扩增出287 bp单一明亮的目的条带,可检测的最低DNA浓度达1 fg·μL^-1,利用该方法对燕麦叶片、燕麦种子及种植地土壤样本进行检测,均能够特异地检测到C. cereale。该方法具有快速、准确、高效、灵敏度高等特点,可用于燕麦炭疽病的田间诊断和检测,为及时开展病害防控提供科学依据。

为实现大麦黄矮病毒-GAV(barley yellow dwarf virus-GAV, BYDV-GAV)的早期快速检测,以BYDV-GAV CP基因序列为模板,设计筛选了RT-RPA扩增引物及LFD探针,建立了RPA检测方法,对恒温扩增条件进行了优化,进一步评估了RT-RPA检测方法的灵敏度和特异性,并开展了田间样品的检测分析。结果显示,引物GAV-RPA-F4/R4和GAV-RPA-F6/R6可高效扩增BYDV-GAV,分别配合GR-nfo-pb4和GR-nfo-pb6探针,可实现侧向层析试纸条检测。最佳反应体系为50.0 μL:MgAc 2.5 μL,RPA Buffer 29.5 μL,上、下游引物 (10 mmol·L^-1)各2.4 μL,cDNA 2.0 μL,RNase-free ddH₂O 11.2 μL;最优反应条件为37 ℃扩增25 min,采用PCR仪进行扩增。该检测方法稳定性好,最低检测阈值和RT-PCR方法一致,均为2.3×10^<sup>-2 ng·μL^-1 (6.03×10⁶ copies·μL^-1),可特异性检出BYDV-GAV,对BYDV-PAV、BYDV-GPV、小麦矮缩病毒(wheat dwarf virus,WDV)、小麦蓝矮植原体(wheat blue dwarf,WBD)等引起黄化矮缩类症状的小麦病原无交叉反应。田间小麦样品检测发现BYDV-GAV带毒率较高,叶片表现黄化症状的疑似黄矮样品中BYDV-GAV检出率为57.8%(11/19)。表明所建立的RT-RPA检测方法可用于田间小麦BYDV-GAV的早期快速检测。

番茄斑驳花叶病毒(tomato mottle mosaic virus, ToMMV)是近年来发现的一种新的烟草花叶病毒属Tobamovirus病毒,主要侵染番茄、辣椒、茄子等茄科作物,严重影响果实的产量和品质。本研究根据ToMMV编码外壳蛋白的基因保守序列,设计重组酶介导等温核酸扩增技术(recombinase-aided amplification,RAA)特异性引物和簇状规则间隔短链重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)及相关蛋白12a(CRISPR-associated 12a,Cas12a)的crRNA并挑选报告基因,通过优化反应体系及特异性和灵敏度的验证,建立了ToMMV快速灵敏的可视化检测方法。优化结果显示,当报告基因FQ终浓度为300 nmol·L^-1、Cas12a/crRNA比例为1∶5、终浓度为200 nmol·L^-1和1 000 nmol·L^-1条件下检测效果最好,最终RT-RAA和CRISPR/Cas12a显色体系只需分别反应15 min,通过便携式蓝光照射设备可以直接观察到阳性信号。实际样品检测结果显示,本研究建立的检测技术可以在辣椒和番茄中检测到ToMMV。该方法可特异性检测ToMMV,对携带ToMMV样品的RNA检测灵敏度可达2.5 pg·μL^-1,是RT-PCR检测灵敏度的100倍,可用于ToMMV快速灵敏的可视化检测。

洋葱黄矮病毒(onion yellow dwarf virus,OYDV)是影响葱属作物产量和质量的主要病毒之一。OYDV高效检测方法的建立对葱属作物OYDV病害防控具有重要意义。本研究小组利用制备的8株OYDV单克隆抗体,通过筛选最佳配对抗体,建立了基于单抗3D3的检测OYDV的单抗夹心ELISA(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)方法,并对反应条件进行优化。该方法对OYDV感染的分蘖洋葱叶片的检测灵敏度为2 560倍稀释,对纯化的重组OYDV衣壳蛋白的最低检测限为11.71 ng·mL^-1,检测感染葱属作物的葱潜隐病毒和胡葱黄条病毒呈阴性反应,且与RT-PCR方法的一致率为96%。本研究建立的检测OYDV的双抗夹心ELISA方法的样品和检测抗体同时孵育,简化了检测步骤,在1 h内即可完成检测;检测OYDV的双抗夹心ELISA方法的建立为该病毒的检测、脱毒种球生产、抗性种质资源鉴定等提供技术支持。

人参链格孢(Alternaria panax)是人参黑斑病的主要致病菌之一,可侵染人参地上部的叶片、茎秆和果实,引起叶枯、茎秆坏死及果实干瘪,对人参产量及品质影响很大。本研究以人参链格孢为研究对象,建立根癌农杆菌介导的遗传转化方法。为了进一步验证遗传转化体系的可行性,对人参链格孢赖氨酸合成相关基因ApLYS2进行了敲除。结果表明,当共培养时间为48 h,共培养温度为22 ℃,农杆菌菌液浓度OD₆₀₀为0.6,原生质体浓度为10⁶个·mL^-1时,转化效率最高,转化率约为23个/10⁶个·mL^-1,潮霉素抗性基因成功转入人参链格孢中;采用本研究所构建的遗传转化方法,成功实现了赖氨酸合成相关基因ApLYS2的敲除。所获得的基因缺失突变体ΔAplys2-4和ΔAplys2-7无法在缺乏赖氨酸的培养基上生长,外源添加赖氨酸突变体生长得到恢复。本研究成功构建了农杆菌介导的人参链格孢遗传转化体系并以赖氨酸合成相关基因ApLYS2的成功敲除进行了验证,为其致病机制研究提供了有效的技术手段。

褐斑病是影响苹果产量和品质最重要的叶部病害,研究旨在构建苹果褐斑病菌(Marssonina coronaria)的TaqMan实时荧光定量PCR(TaqMan qPCR)检测体系,为苹果褐斑病的早期诊断和预测预报提供依据。本研究基于苹果褐斑病rDNA-ITS保守基因,设计M. coronaria的两条特异性引物(HB-Taq-F/R)和一条特异性探针(HB-Taq probe),建立并优化TaqMan qPCR反应体系,运用已构建的体系对人工接种M. coronaria的潜育期叶片内病原菌DNA进行定量检测,分析接种时间与叶片内M. coronaria潜伏侵染量的关系,并完成田间样品的定量检测。通过分析不同时间采集的样品检测结果,证明本检测方法可以在病害显症前10 d检测到M. coronaria。本方法可以用于病害的早期无症状检测,实现苹果褐斑病的检测和早期监测。

日本山药花叶病毒(Japanese yam mosaic virus,JYMV)是最重要的山药病毒之一,影响山药产量和品质。本研究通过对来自河南、山东和江苏的JYMV分离株的外壳蛋白(coat protein,CP)氨基酸序列进行分析,筛选出亲缘关系较远的3株分离株JYMV-WX3、JYMV-SG1和JYMV-FX1,将其CP基因与pET-30a原核表达载体连接并进行原核表达,纯化融合蛋白后进行等比例混合,免疫新西兰大白兔制备多克隆抗血清,经抗原亲和纯化获得的多克隆抗体针对纯化的JYMV-CP的效价为1:512 000。基于该抗体还建立了针对JYMV-CP的酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)、免疫斑点杂交(dot-blot enzyme-linked immunosorbent assay, Dot-ELISA)和免疫捕获反转录聚合酶链式反应(Immuno-capture reverse transcription-polymerase chain reaction, IC-RT-PCR)检测方法。IC-RT-PCR对山药叶汁中JYMV的检测灵敏度比ELISA高2个数量级,IC-RT-PCR的灵敏度为1:100 000倍稀释(w/v, g·mL^-1),而Dot-ELISA和ELISA的灵敏度分别为1:100和1:1 000倍稀释(w/v, g·mL^-1)。本研究建立的JYMV免疫学检测方法可用于山药种质交流、健康种苗生产和田间病害流行监测等应用场景,辅助该病毒的致病机制研究。

蚕豆萎蔫病毒 2(broad bean wilt virus 2,BBWV 2)属于蚕豆病毒属(Fabavirus),是地黄和山药上的重要病毒之一,严重影响这些中药材的产量和品质。本研究建立了BBWV 2的环介导恒温扩增(reverse transcription loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP)检测方法。根据BBWV 2 基因组RNA2上的小外壳蛋白(small coat protein,SCP) 基因序列的保守区设计引物,对RT-LAMP的反应温度和时间进行了优化,最佳反应条件为60～65 ℃反应60 min对其灵敏度、特异性和准确性进行了检测,RT-LAMP方法的灵敏度是常规PCR的10倍,为6.47×10³拷贝·μL^-1,可特异地检测出BBWV 2,对田间地黄、白术和白芷检测的准确性高于常规PCR,对山药检测的准确性度与常规PCR一致。本研究建立的RT-LAMP是一种特异、灵敏、快速、方便的BBWV 2检测方法,适用于基层科研单位对该病毒的准确检测和诊断。

果生刺盘孢(Colletotrichum fructicola)是引起李树炭疽病的优势病原菌,属于胶孢刺盘孢复合群(C. gloeosporioides species complex)。本研究对该复合群中36个菌株的ApMat序列进行比对,进而根据C. fructicola特异性位点设计了1对针对该菌的特异性引物:F2(5′-CGTGACCCAGGAGGCGACCACGCATCTGT-3′)和R2(5′-GGTGATCTCCTAGCGTTCGTACGTCTAAT-3′),在此基础之上建立了PCR检测体系。结果表明,引物F2/R2可从C. fructicola基因组DNA中扩增出长度为132 bp的特异性目的条带,检测灵敏度达100 fg·μL^-1。利用该检测体系可从人工接种C. fructicola HN47-2菌株的李树叶片以及田间自然染病的李树叶片样品中快速检测出目标条带。本研究针对C. fructicola建立的灵敏、快速的特异性PCR检测方法为该菌引起的李树炭疽病的田间早期诊断、动态监测和精准防控提供了重要的技术支撑。

茉莉生长过程中普遍受到多种病毒的复合侵染。由于缺乏病毒与症状关系的系统研究,仅通过症状很难准确分辨茉莉被何种病毒侵染,所以建立快速精准诊断多种茉莉病毒病的检测技术具有重要应用价值。本研究建立了一种可同时检测4种茉莉病毒——茉莉T病毒(jasmine virus T,JaVT)、茉莉C病毒(jasmine virus C,JaVC)、茉莉H病毒(jasmine virus H,JaVH)和茉莉A病毒(jasmine virus A,JaVA)——的一步法多重逆转录PCR(one-step multiplex reverse transcription-PCR,RT-PCR)体系,其最优反应体系为:在总体系20.0 μL中,JaVT、JaVC、JaVH和JaVA的上下游引物浓度分别为200、150、100和150 nmol·L^-1,One-step Enzyme Mix:0.2 μL,2×反应缓冲液:10.0 μL,模板量:1.0 μg;多重RT-PCR参数设定为:RNA反转录50 ℃ 30 min;预变性94 ℃ 2 min;94 ℃变性30 s;55 ℃退火30 s;72 ℃延伸45 s,30个循环;72 ℃整体延伸10 min。研究结果表明建立的一步法多重RT-PCR可同时高效精准地检测4种茉莉病毒,极大地提高了检测效率,可被广泛应用于实验室精准、高效检测和田间茉莉病毒病的检测。

油菜花叶病毒(youcai mosaic virus, YoMV)是侵染地黄和山药的重要病毒之一,能导致中药材的产量下降及品质降低。本研究基于逆转录环介导恒温扩增技术(reverse transcription loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP),建立了针对YoMV的快速、特异、灵敏的RT-LAMP检测方法。根据YoMV外壳蛋白(coat protein,CP)的核苷酸序列设计了5条特异性引物,建立的RT-LAMP方法最适检测温度为60 ℃,反应时间为60 min,该方法能特异性检测到YoMV,灵敏度是常规PCR的1 000倍,可检测9.18×10²拷贝·μL^-1模板,本研究建立的RT-LAMP检测技术为地黄和山药上YoMV的准确鉴定提供了快速、高效的方法。

本研究针对李树皮坏死茎痘病毒(plum bark necrosis stem pitting-associated virus, PBNSPaV),一种长线型病毒科(Closteroviridae)、葡萄卷叶病毒属(Ampelovirus)的正单链植物RNA病毒,利用大肠杆菌进行异源表达和纯化其编码的RNA依赖的RNA聚合酶(RNA dependent RNA polymerase, RdRp)。通过体外实验发现,异源表达的重组RdRp具备复制酶活性,并能够识别PBNSPaV基因组的3′UTR区域,从而建立了RdRp介导的PBNSPaV体外转录体系。樱桃上病毒病多存在复合侵染现象,同科病毒之间的RdRp能否具有通用性未见报道,本研究选取田间对产量影响较重的同科病毒樱桃小果1号病毒(little cherry virus-1, LChV-1),利用已经建立的该病毒体外转录体系探究RdRp的通用性,实验结果显示,异源表达的LChV-1 RdRp无法有效识别PBNSPaV相关启动子序列,表明该两种病毒的RdRp不具有通用性。本试验所创建的体外转录体系可用于研究PBNSPaV复制调控研究。