2017年, 第47卷, 第3期　刊出日期：2017-06-10

  

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特邀专题评述
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  一种高效构建多位点突变重组质粒的方法

  孙晓梅,赵彦翔,梁文星,刘俊峰,黄金光

  植物病理学报. 2017, 47(3): 289-295. https://doi.org/10.13926/j.cnki.apps.000042

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  定点突变技术是蛋白质结构与功能研究的必要手段之一, 随着蛋白质结构生物学深入发展, 研究中要同时构建多位点、批量表达载体, 研究者基于重叠延伸PCR和双接头PCR方法, 优化建立一种高效构建多位点突变重组表达质粒的方法。
病原学
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  四川省鹅掌柴炭疽病病原菌的初步鉴定

  李沛利,李娟,龚国淑,杜俊煜,严吉明

  植物病理学报. 2017, 47(3): 296-304. https://doi.org/10.13926/j.cnki.apps.000068

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  炭疽病是鹅掌柴发生最严重的病害之一。本文从四川省成都市采集疑似为炭疽病的鹅掌柴病叶,进行了分离培养,获得培养形态完全不同的2株炭疽菌,致病性测定发现它们都为致病菌。多基因 (核糖体内转录间隔区、肌动蛋白、3-磷酸甘油醛脱氢酶、几丁质合成酶、β-微管蛋白、钙调蛋白) 的系统发育分析发现,分离获得的2株炭疽菌分别与暹罗炭疽菌(Colletotrichum siamense)和喀斯特炭疽菌(C. karstii)聚在一起,形成一个明显的分支,结合形态学特点,确定引起成都市鹅掌柴炭疽病的病原菌为暹罗炭疽菌和喀斯特炭疽菌,这是关于这两种病原引起鹅掌柴炭疽病的首次报道。本文还研究了不同的回接方式对致病性测定的影响,砂纸擦拭后选取中老叶片用孢子悬浮液接种是对鹅掌柴炭疽病最好的致病性测定方法。
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  中国不同地理来源谷瘟病菌rDNA-IGS序列分析

  任世龙,白辉,董立,董志平,全建章,李志勇,邢继红

  植物病理学报. 2017, 47(3): 305-312. https://doi.org/10.13926/j.cnki.apps.000020

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  由谷瘟病菌引起的谷瘟病是我国谷子的主要病害之一,谷瘟病发生可造成谷子大量减产。为了研究谷瘟病菌群体遗传结构和进化关系,本研究对64个谷瘟病菌的rDNA-IGS序列进行扩增检测和测序分析,结果表明,谷瘟病菌之间IGS序列的长度存在着明显的多态性。进一步序列分析发现,IGS序列中重复单元(GGGGGTGCAGGGTA和CATTTTT)的重复次数的不同是造成序列长度差异的主要原因,并且发现IGS基因序列具有寄主特异性。采用最大似然法对所获得的IGS序列进行系统发育树分析,将谷瘟病菌划分为3个谱系。谷瘟病菌遗传分化明显,具有丰富的多样性,分析表明影响谷瘟病菌IGS基因遗传分化的环境因素主要为寄主因素。研究结果为今后深入研究谷瘟病菌群体遗传结构提供理论支持。
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  小麦幼苗内生菌多样性的宏基因组分析

  赵芹,邓渊钰,李伟,孙海燕,夏云磊,陈怀谷

  植物病理学报. 2017, 47(3): 313-324. https://doi.org/10.13926/j.cnki.apps.000044

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  小麦是世界各地广泛种植的重要禾本科作物,在生长过程中与内生菌形成和谐共生的微生态体系,内生菌次生代谢产物具有抗病、防虫与促生等重要作用。宏基因组技术是研究环境微生物及内生菌多样性的重要手段。本研究首先富集纯化幼苗期小麦内生菌的宏基因组DNA,PCR扩增内生细菌的16S rDNA及内生真菌rDNA-ITS序列,构建了大肠杆菌克隆文库,选取阳性克隆测序。根据16S rDNA信息及系统进化树对内生细菌群初步分析,划分为9个分类操作单元(operational taxonomic unites,OTUs),主要包括γ-变形菌纲肠杆菌科(95.59%)、梭菌纲(1.47%)及不可培养细菌(2.94%),其中肠杆菌科菌群为优势菌。内生真菌rDNA-ITS克隆序列根据序列相似性和系统发育分析划归为13个OTUs,主要为不可培养真菌(37.50%)与子囊菌(62.50%),后者分属于半子囊菌纲(30.00%)、座囊菌纲(5.00%)与粪壳菌纲(27.50%)3个菌纲,其中不可培养真菌为优势菌。上述研究结果表明小麦幼苗内生菌遗传多样性分布较广,本研究为进一步挖掘利用小麦内生菌资源提供了基础信息。
细胞生物学、生理学、生物化学、分子生物学
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  大豆花叶病毒引发大豆不同症状的生理特性比较

  张锴,王宇,王涛,高乐,任锐,殷金龙,李凯,智海剑

  植物病理学报. 2017, 47(3): 325-332. https://doi.org/10.13926/j.cnki.apps.000103

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  以接种3个SMV株系后分别表现无症状、花叶和坏死症状的大豆品系浙A8901为材料,研究3类症状叶片的生理指标差异,包括细胞超微结构、H₂O₂积累、水杨酸(SA)含量、光合作用及细胞病毒含量。结果表明:无症状叶片细胞中除叶绿体片层结构轻微扭曲外,其它细胞结构未见异常;CeCl₃标记H₂O₂电镜观察,发现H₂O₂仅在细胞壁外侧少量积累;在接种1 d后SA含量较对照显著升高。花叶症状叶片细胞中出现髓鞘状结构和多泡体结构,核膜边缘有染色质凝集现象;细胞壁外侧观察到较多H₂O₂的积累;SA含量在接种后第2 d较对照显著增加。坏死症状叶片中细胞变形严重,细胞器解体,在细胞壁外侧和细胞质中均观察到H₂O₂的大量积累;接种后第2 d SA含量较对照显著增加。三类症状叶片的光合速率、最大光能转化效率(Fv/Fm)和实际光量子效率(ΦPSⅡ)的测定发现,与对照相比均无显著变化。

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  建兰花叶病毒RdRp基因的原核表达及多克隆抗体制备

  万晴姣,吴正强,李欲轲,乙引,龚记熠,刘倩,洪鲲

  植物病理学报. 2017, 47(3): 333-339. https://doi.org/10.13926/j.cnki.apps.000102

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  采用RT-PCR技术扩增出建兰花叶病毒贵州分离物(CyMV-GZ)的依赖RNA的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase,RdRp)基因保守序列。测序结果表明:该RdRp基因序列长735 bp,编码245个氨基酸残基。构建原核表达载体pET32a(+)-RdRp,将重组质粒转化大肠杆菌 BL21(DE3),在37℃以0.3 mmol·L^-1 IPTG诱导表达分子量约49 kDa重组蛋白。以该重组蛋白为抗原免疫小鼠,制备的抗体效价达1∶204 800。间接ELISA检测显示该多抗与CyMV病叶汁发生特异性免疫反应,而与其他6种同属或不同属病毒叶汁无血清学交叉反应。本实验为进一步研究RdRp的功能以及从分子水平上探讨该病毒的致病机制奠定了基础。
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  ywbB基因对枯草芽胞杆菌NCD-2菌株菌落形态和芽胞形成的调控

  郭庆港,王培培,李社增,鹿秀云,赵卫松,张晓云,马平

  植物病理学报. 2017, 47(3): 340-347. https://doi.org/10.13926/j.cnki.apps.000058

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  枯草芽胞杆菌NCD-2菌株能有效防治作物土传病害,前期研究证实,ywbB基因正调控NCD-2菌株生物膜形成和根际定殖能力。本研究进一步分析了ywbB基因对NCD-2菌株的生长、菌落形态和芽胞产生等性状的影响。结果表明,同NCD-2野生型菌株相比,突变子ΔywbB降低了在LB和2×SG培养基中的生长速率;在LB或2×SG培养基上,NCD-2菌株可以形成褶皱的菌落形态,而ΔywbB 突变子菌落形态平坦,没有褶皱。在2×SG培养基中培养60 h后,NCD-2菌株的芽胞形成率达到68.6%,而ΔywbB突变子的芽胞形成率仅为18.5%。通过RT-qPCR技术分析了ywbB突变后对其上游基因ywbA、下游基因ywbC、芽胞形成相关基因spoIIAA表达量的影响,结果表明,突变ywbB后对ywbA、ywbC基因的表达量没有明显的影响,而ΔywbB突变子中spoIIAA的表达量较NCD-2野生型菌株相比显著降低。
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  小麦黄花叶病毒(WYMV) 2个山东分离物的全基因组序列及进化分析

  耿国伟,于成明,王德亚,顾珂,师科荣,李向东,田延平,原雪峰

  植物病理学报. 2017, 47(3): 348-356. https://doi.org/10.13926/j.cnki.apps.000104

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  利用5′RACE结合一步法RT-PCR分别从山东泰安与临沂冬小麦上克隆了小麦黄花叶病毒(Wheat yellow mosaic virus,WYMV)的全基因组序列。这2个分离物(TADWK和LYJN)基因组间核苷酸一致性分别为97.21 % (RNA1)和95.12 %(RNA2)。通过对目前已报道的共14个分离物的基因组不同部分的分析,表明5′UTR是WYMV基因组变化幅度最大的区域,而编码区(ORF)及3′UTR的序列一致性较高且变动幅度小。另外,发现LYJN RNA2的5′UTR与已报道的所有分离物RNA2的核苷酸一致率仅为90%左右。综合分析RNA1和RNA2的系统发生树,表明WYMV各基因组片段呈单独进化特征,不同分离物间存在RNA重排。 RNA重组分析显示在LYJN RNA1和TADWK RNA2发现了RNA重组。此研究说明WYMV在山东地区存在分离物分化现象,WYMV的5′UTR是基因组中的突变热点。

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  甘蔗花叶病毒2个山东分离物的全基因组序列分析

  程德杰,闫志勇,黄显德,田延平,原雪峰,李向东

  植物病理学报. 2017, 47(3): 357-363. https://doi.org/10.13926/j.cnki.apps.000106

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  甘蔗花叶病毒(Sugarcane mosaic virus,SCMV)是引起我国玉米矮花叶病的主要病毒。本文从山东泰安采集到2个表现矮花叶症状玉米样品的分离物(命名为DWK1和DWK2),通过RT-PCR扩增全基因组片段并测定了其序列(GenBank登录号分别为KU171814和KU171815)。序列分析结果表明,DWK1和DWK2基因组全长分别为9 575和9 576个核苷酸(nucleotides,nt),开放阅读框均为9 192 nt,编码3 063个氨基酸的多聚蛋白。DWK1和DWK2的全基因组核苷酸一致率为81.7%,DWK1与山西分离物SX(AY569692)的核苷酸一致率最高,为90.9％; DWK2与河北分离物BD8(JN021933)核苷酸一致率最高,达99.4%。二者在系统进化树中分别被聚类到Ⅰ组和Ⅳ组。重组分析发现,DWK1是HN(AF494510)、Guangdong(AJ310105)和BD8 3个分离物的重组体。选择压力分析表明,SCMV 11个蛋白的d_N/d_S值都小于1,均处于负选择,但在P1、P3和CP中存在正选择位点。本研究结果可为甘蔗花叶病毒株系的监测及防控提供理论指导。
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  利用高通量测序分析侵染贵州火龙果的病毒

  郑乾明,王壮,彭志军,马玉华,蔡永强

  植物病理学报. 2017, 47(3): 364-369. https://doi.org/10.13926/j.cnki.apps.000101

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  对疑似感染病毒的火龙果(Hylocereus undatus Britt.)进行高通量测序,分析病毒种类和相对含量,为火龙果病毒诊断和检测提供理论基础。测序reads经拼接和注释,共3 969条contig注释为病毒,包含44 354 147条reads。10条contig注释为CVX-NTU(JF937699),其含有的reads占所有病毒reads数量的85.18%;10条contig注释为ZyVX(AY366208),占所有病毒reads数量的4.97%;6条contig注释为SchVX(AY366207),占所有病毒reads数量的3.75%;6条contig注释为CVX(AF308158),占所有病毒reads数量的0.26%。拼接获得的CVX-NTU序列完全覆盖CVX-NTU(JF937699)基因组,核苷酸序列一致性为97%。编码的5个ORF核苷酸序列与CVX-NTU(JF937699)一致性为97%~98%,氨基酸序列一致性为97%~99%。拼接获得的CVX-NTU序列与CVX、ZyVX和SchVX的核苷酸序列一致性分别为78%、75%和70%。这是首次利用高通量测序检测火龙果病毒的报道。
致病性与抗病性遗传
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  小麦品种(系)抗白粉病基因推导及分子标记鉴定

  高海峰,范洁茹,周益林,王锁牢,白微微,李广阔

  植物病理学报. 2017, 47(3): 370-379. https://doi.org/10.13926/j.cnki.apps.000057

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  利用基因推导法和分子标记对我国主要麦区的小麦品种（系）进行了抗白粉病基因的鉴定。结果表明，南30-10等15个品种（系）含有Pm8，新麦2号等9个品种（系）含有m4，中植4号等9个品种（系）含有Pm21，郑麦113含有Pm4b+5b，杨09-111和新紫1号含有Pm2+mld。研究发现，基因推导和分子标记相结合，可大大提高小麦品种（系）抗白粉病基因鉴定结果的准确性，鉴定结果可为抗病育种和品种布局及白粉病的防治提供依据。

特邀专题评述
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  苹果斑点落叶病菌对戊唑醇敏感基线建立及抗性突变体适合度

  任璐,史晓晶,姚众,韩巨才,赵晓军

  植物病理学报. 2017, 47(3): 380-388. https://doi.org/10.13926/j.cnki.apps.000014

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  本研究测定了苹果斑点落叶病菌对戊唑醇的敏感性,并建立了敏感基线;在此基础上,室内筛选获得了9株抗戊唑醇突变体,对其适合度进行了测定,为指导戊唑醇防治苹果斑点落叶病提供理论依据。在山西省5个地市未使用过戊唑醇及同类药剂的果园中采集分离得到64株苹果斑点落叶病菌,敏感性测定结果表明,其EC₅₀值在0.768 7~2.673 8 μg·mL^-1之间,平均值为1.622 4±0.558 2 μg·mL^-1,呈连续性单峰曲线,可作为苹果斑点落叶病菌对戊唑醇的相对敏感基线。通过紫外线(UV)诱导获得低抗突变体6株,药剂驯化获得中抗突变体3株。2株中抗突变体抗药性可稳定遗传;低抗突变体在无药剂胁迫时,药剂敏感性上升。抗性突变体适合度测定结果显示,突变体菌丝生长速率、产孢量、孢子萌发率及分生孢子竞争力均低于敏感菌株。突变体在无药情况下致病力比敏感菌株弱。
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  不同时期的柑橘果实中真菌种类分析

  赵莹,梁克力,贾纪春,郭大勇,程家森,   谢甲涛,陈桃,付艳苹

  植物病理学报. 2017, 47(3): 389-397. https://doi.org/10.13926/j.cnki.apps.000021

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  柑橘采后真菌病害发生普遍,对柑橘产业造成了极大的威胁。柑橘体内存在丰富的真菌类群,为了了解柑橘成熟和衰老过程中果实内生真菌的多样性和变化动态,本论文通过MiSeq技术解读真菌ITS区域序列,分别对生长期、成熟期和贮藏期的晚蜜一号果实的果皮和果肉的内生真菌种类进行了分析。发现相比于果肉,果皮中真菌在目和属水平的多样性更为丰富,而成熟期果肉中真菌种类多于果皮。不同生长阶段的两种组织中优势的真菌属也不同,果皮在生长期以Medicopsis和刺盘孢属(Colletotrichum)占绝对优势,成熟期为刺盘孢属,贮藏期以葡萄孢属(Botrytis)、Erythrobasidium和Strelitziana较为常见;而果肉中生长期主要为青霉属(Penicillium)和枝孢菌属(Cladosporium),约占1/4,成熟期半数以上为葡萄孢属,及至贮藏期约90%为链格孢属(Alternaria)和青霉属,其中链格孢属约占2/3。常见植物病原真菌如枝孢菌属(Cladosporium)、巨座壳属(Magnaporthe)、核盘菌属(Sclerotinia)、葡萄孢属(Botrytis)、白粉菌属(Erysiphe)、青霉属(Penicillium)、链格孢属(Alternaria)和镰孢霉属(Fusarium)等在果肉中的数量高于果皮。果肉中存在较大数量的常见植物病原真菌,不同属真菌在不同样品中呈不同的变化动态,暗示采后病变是多种真菌交互作用的结果,采后病害的防治可以提前至开花期。
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  白薇提取液对意大利青霉抑菌机理及脐橙青霉病防治效果的研究

  彭旋,陈玉环,陈金印

  植物病理学报. 2017, 47(3): 398-405. https://doi.org/10.13926/j.cnki.apps.000041

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  试验以意大利青霉(Penicillium italicum)为供试菌,研究不同白薇提取液浓度对意大利青霉孢子萌发率、菌丝体总糖和可溶性蛋白质含量、苹果酸脱氢酶和琥珀酸脱氢酶活性以及培养液电导率的影响,并观察测定白薇提取液对脐橙青霉病的防治效果。结果显示:白薇提取液能够抑制意大利青霉的孢子萌发,在浓度为50.00 mg·mL^-1时,孢子萌发的抑制率高达95.43%,此外,白薇提取液还能增强菌丝体细胞膜渗透性,降低菌丝体总糖和可溶性蛋白质含量以及苹果酸脱氢酶和琥珀酸脱氢酶活性,显著降低果实病斑直径。白薇提取液主要是抑制意大利青霉孢子的萌发、破坏细胞膜结构以及降低能量代谢酶活性,从而扰乱意大利青霉正常生长,减少脐橙青霉病的发生。
研究简报
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  陕西石榴枝条干腐病的病原鉴定

  王含,王娟,张迎军,陈海芬,王阳,马青

  植物病理学报. 2017, 47(3): 406-410. https://doi.org/10.13926/j.cnki.apps.000018

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  南疆红枣黑斑病病原鉴定及其保守基因序列分析

  宋博,徐兵强,朱晓锋,阿布都克尤木·卡德尔,杨森*

  植物病理学报. 2017, 47(3): 411-415. https://doi.org/10.13926/j.cnki.apps.000013

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  辣椒疫霉侵染拟南芥的酵母双杂交cDNA文库构建及其应用

  汪俭,李敏,张鹏,纪志远,马立安,乔永利

  植物病理学报. 2017, 47(3): 416-421. https://doi.org/10.13926/j.cnki.apps.000016

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  利用小RNA高通量测序技术检测玉米病毒

  王芳,高正良,周本国,赵霞

  植物病理学报. 2017, 47(3): 422-427. https://doi.org/10.13926/j.cnki.apps.000105

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  黄瓜花叶病毒在中国的新寄主—百日草

  李正男,宋爽,吴云锋

  植物病理学报. 2017, 47(3): 428-432. https://doi.org/10.13926/j.cnki.apps.000107

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