甘蔗镰孢菌(Fusarium sacchari)是引致甘蔗梢腐病的主要病原真菌之一。为明确F. sacchari中金属蛋白酶(metalloproteinase)类效应蛋白的功能,本研究前期利用F. sacchari基因组数据对其具有分泌性的金属蛋白酶基因进行预测,从中扩增得到一个锌依赖型金属蛋白酶类效应蛋白基因Fs03538,并对其功能进行了初步研究。结果显示:Fs03538含有一个典型的锌依赖型金属蛋白酶结构域(ZnMc super family),蛋白质N端的1-18个氨基酸序列含有特定的分泌信号序列,亚细胞定位显示Fs03538能够定位于植物细胞核中;qRT-PCR分析表明Fs03538在甘蔗镰孢菌侵染甘蔗12 h到达最高峰值,之后表达量持续维持在较高水平;根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的烟草瞬时表达系统确定Fs03538可以抑制小鼠促凋亡蛋白BAX引起的烟草细胞坏死,在F. sacchari中敲除Fs03538后发现突变体在生长速度、产孢量与野生型无明显差异,但致病力显著下降。以上结果表明,Fs03538在F. sacchari入侵寄主的过程中高量表达,可能通过进入寄主细胞核中抑制寄主免疫响应,是F. sacchari重要的毒力因子。

茄腐镰孢菌(Fusarium solani)寄主范围广泛,可引发生产上的毁灭性病害—根腐病。分泌蛋白在病原菌对植物的侵入、定殖和扩展等致病过程中起着重要作用,本研究利用SignalP、TMHMM、WoLF PSORT和PredGPI等软件对F. solani全基因组编码的17654条蛋白序列进行了分泌蛋白和效应子的预测分析,结果表明:F. solani基因组中有1032个分泌蛋白基因,占编码蛋白基因总数的5.85%。进一步利用dbCAN3等软件对经典分泌蛋白中的碳水化合物活性酶 (Carbohydrate-active enzymes, CAZymes) 进行预测,发现其中258个为CAZymes,以糖苷水解酶亚家族成员最多。分泌蛋白中效应蛋白(effector)的预测结果表明,F. solani中有185个潜在的效应蛋白,其中183个蛋白的功能可被PHI数据库注释到。利用农杆菌介导的植物瞬时表达系统,在本氏烟中对其中5个注释为增加F. solani毒力的效应蛋白进行验证,发现其中2个候选效应蛋白(XP_046140852.1 和XP_046131041.1)能够抑制由Bcl2关联X蛋白BAX (BCL2-associated X protein) 引起的细胞程序性死亡,可能在F. solani侵染致病过程中起重要作用。研究结果有助于揭示F. solani的致病分子机制,同时为F. solani与植物互作的深入研究提供了理论依据。

水稻是世界上重要的粮食作物。虽然针对水稻上为害严重的稻瘟病和白叶枯病,目前已克隆并鉴定了一些抗病基因,但相应的抗病资源依旧匮乏。本研究发现乙烯途径转录因子OsEIL4参与调控水稻对稻瘟病和白叶枯病的抗性反应。通过实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR, qPCR)检测发现OsEIL4基因在稻瘟菌(Magnaporthe oryzae)和白叶枯菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae)侵染时均诱导表达。所构建OsEIL4转基因水稻植株的抗病性分析结果显示,相比于野生型材料,OsEIL4基因编辑(OsEIL4敲除)和基因沉默水稻植株对这两种病原菌的抗性减弱,而OsEIL4过表达植株对二者的抗性增强。此外,qPCR检测发现,乙烯信号通路标记基因和防御基因OsPR1a和OsPR5在OsEIL4基因编辑稻株中下调表达,而在OsEIL4过表达稻株中上调表达,表明OsEIL4作为乙烯途径的正调控因子可通过调控防御基因表达介导水稻抗病性。亚细胞定位和酵母单杂交结果表明OsEIL4具有转录因子的特性,预示其可能通过行使转录调控功能参与水稻免疫反应。本研究挖掘到了一个具有广谱抗性的基因资源,将为水稻抗病分子育种提供新思路。

为了阐明灰葡萄孢(Botrytis cinerea)蛋白质-蛋白质之间的互作关系,深入探究B. cinerea致病的分子机理,本研究使用同源映射(Interolog)方法,构建了一个包含2 296个蛋白和9 376对互作的B. cinerea蛋白质-蛋白质互作网络(PPI)图谱;并使用结构域-结构域相互作用(Domain-domain interactions)方法,对构建的B. cinerea蛋白质-蛋白质互作网络图谱进行了进一步的筛选和优化,构建了一个包含1 233个蛋白和2 585对互作的高可信度的蛋白质-蛋白质互作网络,利用MCODE算法将该网络图划分为27个功能模块,并对已知致病相关蛋白GB1、RAS2、BMP1和BMP3的互作蛋白子网络进行了分析;利用酵母双杂交技术对该蛋白质互作网络中BofuT4_P103090与BofuT4_P056160和BofuT4_P007800蛋白之间的互作关系进行验证,确定了BofuT4_P103090与BofuT4_P056160和BofuT4_P007800蛋白存在互作关系,验证了本研究所构建的蛋白质-蛋白质互作网络的可靠性。研究结果为阐明B. cinerea致病分子机理研究奠定基础,并为其他物种的蛋白质-蛋白质互作网络及其致病机理研究提供参考。

群结腐霉(Pythium myriotylum)是一种植物病原卵菌,可侵染大豆、番茄、小麦等多种重要经济、粮食作物,引起根腐、茎基腐病,造成严重危害。本研究报道一个来源于P. myriotylum的碳酸酐酶家族蛋白(Carb anhydrase)-PmCA1,发现其在P. myriotylum侵染植物过程中上调表达,同时其可抑制flg22诱导的活性氧迸发及防御相关基因表达,促进辣椒疫霉(Phytophthora capsici)的侵染。以上结果表明PmCA1可能是P. myriotylum的毒性因子,通过抑制植物PTI免疫反应来促进病原菌侵染定殖。研究结果将为P. myriotylum分泌蛋白的功能研究提供思路,为探究P. myriotylum的致病机制提供理论支撑。

马铃薯早疫病(Potato Early Blight,PEB)是马铃薯生长期叶部重要病害,在世界范围内马铃薯各主产区普遍发生,目前没有特效防治药剂或完全抗性的马铃薯品种。本实验利用马铃薯早疫病病原菌Alternaria solani接种云南省主栽品种‘合作88’(Cooperation-88)叶片上,通过AUDPC对比易感早疫病品种‘Désirée’,发现‘合作88’为抗性品种。以‘合作88’接种后不同发病阶段,分别进行早期(A. so_e,0-72 h)、中期(A. so_m,73-120 h)、晚期(A. so_l,>120 h)转录组测序和差异分析。分析发现A. so_e共有13 083个基因差异表达,其中上调表达7 438个,下调表达5 645个;A. so_m共有12 121个基因差异表达,其中上调表达3 299个,下调表达8 822个;A. so_l共有10 530个基因差异表达,其中上调表达1 686个,下调表达8 844。分析3个时期基因差异表达,有2 720个相同基因,A. so_e特有基因4 997个,A. so_m特有基因3 975个,A. so_l特有基因3 230个。通过电镜观察,结合转录组分析和qRT-PCR验证结果,推测在A. solani侵染‘C88’早期,果胶裂解酶和纤维素合成酶合成的增加参与细胞壁重塑,侵染中期‘C88’中谷胱甘肽S-转移酶、细胞色素P450明显上调表达参与解毒途径,晚期合成大量抗氧化物,激发防御机制。3个时期中bHLH、ZIP、MYB、ERF等与抗病相关的转录因子高度表达,广泛参与泛素化途径。该结果可为研究马铃薯抗早疫病提供理论基础,加速抗病育种。

由橡胶树白粉菌(Oidium heveae)引起的橡胶树白粉病是影响橡胶产业的主要叶部病害之一,可导致橡胶树大量落叶,严重影响胶乳产量。培育和种植抗病品种是防治该病害最经济有效的措施,因此研究橡胶树抗白粉病蛋白及其调控网络对于解析橡胶树抗白粉病机制具有重要意义。本研究以O. heveae HO-1菌株接种后48 h和0 h (接种前)混合的古铜期橡胶树叶片为样本,利用Gateway技术构建了白粉菌侵染的橡胶树叶片cDNA初级文库,通过LR重组技术将初级文库分别重组到pGADT7-DEST和pPR3-N-DEST次级文库载体上,构建出膜体系和核体系酵母双杂交次级文库。这两个文库容量均大于1.0×10^-7 CFU,重组率为100%,插入片段长度在0.1~2.0 kb之间,平均长度为1.5 kb。同时,我们分别构建了橡胶树抗病蛋白HbCNL2的全长和富含亮氨酸重复 (Leucine-rich repeat, LRR) 结构域诱饵载体,并在核体系酵母文库中筛选出7个可能与HbCNL2 LRR结构域互作的蛋白。进一步通过酵母双杂交点对点验证,确定了HbKLCR1、HbGAIP这两个蛋白与HbCNL2 LRR结构域的互作。GO注释分析显示HbKLCR1具有蛋白质结合活性,HbGAIP参与赤霉素信号传导过程,二者可能在橡胶树的抗病反应中发挥作用。本研究构建的cDNA文库质量较高,完整性较好,为筛选获得针对白粉病菌的抗病蛋白、解析这些蛋白的功能以及构建蛋白质互作调控网络奠定了基础。

富含亮氨酸重复序列类受体蛋白激酶 (leucine-rich repeat receptor-like protein kinase, LRR-RLK)在植物抵抗病原菌侵染过程中发挥着重要作用。为了明确谷子LRR-RLK基因家族的基本特征,以及该家族成员在谷子对抗白发病菌(Sclerospora graminicola)中的作用,本研究利用生物信息学方法对谷子LRR-RLK基因家族进行了鉴定和分类,对其进化模式、序列特征、基因结构、启动子序列和表达模式进行了分析。进一步利用谷子抗病和感病品种受S. graminicola侵染后3个不同生育期的转录组数据,采用加权基因共表达网络分析(the weighted gene co-expression network analysis, WGCNA)方法,对抗病基因共表达模块和核心基因进行鉴定。结果表明,LRR-RLK家族基因在谷子9条染色体上呈现不均匀分布;对谷子和拟南芥LRR-RLK类基因进行系统进化分析,发现这些基因主要分为4类;多数基因编码的激酶蛋白的结构域相对保守,其启动子区包含防御和应激反应、分生组织表达相关的多种顺式作用元件,表明这些基因可能受多种因子调控;利用 WGCNA 构建与抗病相关的基因共表达网络,共鉴定到 44个基因共表达模块,其中3 个为抗病相关的特异性模块(Turquoise、Blue 和Yellow) ,从中发掘到12个核心基因,功能注释结果表明这些基因参与植物抗病调控;从中选取6个基因 (Seita.9G413000、Seita.9G296000、Seita.9G557200、Seita.9G493600、Seita.3G241700 和Seita.9G163200),利用RT-qPCR分析其表达量,证实了这些基因在S. graminicola侵染的不同时期被诱导表达,推测这些基因可能在谷子抵抗谷子白发病的过程中起着重要作用。研究结果为揭示谷子抗白发病的分子机制提供了参考。

希金斯炭疽菌(Colletotrichum higginsianum)是十字花科植物炭疽病的主要病原菌,在华南地区会严重危害菜心(Brassica parachinensis)的生产。小柱孢酮脱水酶(scytalone dehydratase,Scd)是DHN黑色素生物合成过程中的一个关键酶,在许多植物病原真菌中能够通过介导DHN黑色素的合成来影响致病力。本研究在希金斯炭疽菌中鉴定到一个保守的小柱孢酮脱水酶ChScd;而后通过RT-qPCR技术分析了ChSCD基因的表达情况,发现该基因在希金斯炭疽菌菌丝与附着胞的黑化过程中表达量显著上调;同时利用农杆菌介导的转化技术构建ChSCD基因的敲除与回补突变体菌株,用以分析ChSCD基因的生物学功能。结果表明,ChSCD基因的缺失阻断了希金斯炭疽菌中DHN黑色素的生物合成,菌丝与附着胞均丧失黑化能力,进而使ChscdΔ突变体对细胞壁干扰物质与氧化胁迫的耐受度、附着胞形成率、膨压以及致病能力均显著下降。综上所述,ChScd在希金斯炭疽菌的DHN黑色素的生物合成中具有重要的作用,进而影响该病菌的抗逆性、附着胞的形成率、膨压和致病能力。

柑橘属绝大多数种质易感柑橘溃疡病,柑橘溃疡病严重危害了我国柑橘产业发展。本研究在枸橼基因组中鉴定出88个过氧化物酶(POD)基因,通过系统进化树分析将其分为2类,并通过对柑橘溃疡病具有抗性的枸橼C-05和感病的冰糖橙叶片接种柑橘溃疡病后的转录组分析,获得16个受柑橘溃疡病菌诱导特异表达的POD基因。对在抗、感病种质中表达量较高且差异较大的CmPOD05使用qRT-PCR进一步验证其表达,并通过烟草亚细胞定位确定其可能定位于细胞质膜上。同时分析了不同柑橘种质之间的POD05同源基因蛋白质差异,以及通过启动子序列的顺式作用元件分析,得到防御和应激反应调控等多个抗病相关的顺式作用元件。在冰糖橙叶片中瞬时过表达CmPOD05,在接种溃疡病菌后第3 d,与对照相比单位叶面积的柑橘溃疡病菌生长量显著减少。在枸橼C-05及烟草叶片中瞬时过表达CmPOD05可以增加叶片的H₂O₂及超氧阴离子含量。本研究结果表明CmPOD05可能参与了枸橼C-05对柑橘溃疡病的抗病过程。

象耳豆根结线虫(Meloidogyne enterolobii)具有致病性强、寄主范围广以及扩散迅速等特点,可对作物造成毁灭性危害。为深入解析M. enterolobii的致病机理,本研究以前期转录组数据为基础,以筛选出的番茄根系组织中受M. enterolobii侵染诱导的上调表达基因T106为研究对象,通过RACE技术获得其全长cDNA(423 bp),同源比对和结构模型预测结果显示该基因编码类防御素蛋白。利用TRV病毒诱导的基因沉默技术沉默番茄植株中的T106基因,再对T106沉默和未沉默的植株接种M. enterolobii,观察线虫在番茄根系中的发育情况以及线虫诱导产生的巨型细胞的发育情况,测定根结百分率和线虫产卵量。结果表明,构建的沉默载体能够有效沉默番茄T106基因,沉默效率达85%;沉默植株根结百分率无显著减少,但根结内M. enterolobii的发育受到抑制,产卵量与对照相比减少了79.3%;同时观察到巨型细胞面积相比T106未沉默的对照植株,在各个侵染时期也均有减小。综上所述,T106可能是M. enterolobii靶向的感病基因。挖掘线虫靶向的植物感病基因对于寻找持久抗线虫病的新途径具有重要意义。

由链核盘菌引起的褐腐病严重危害核果和仁果类水果的生产,极大影响我国水果的远距离销售与出口。基于对实生链核盘菌(Monilinia fructicola)基因组学和侵染早期转录组学分析,筛选到MfHMG5和MfHMG6基因在桃褐腐病菌侵染早期各时间段的表达量变化趋势相同,都在侵染1 h后显著下降,而后逐渐上升。为阐明两者的生物学功能,对MfHMG5的敲除和过表达转化子,MfHMG6的敲除和回补转化子的表型进行观察,发现MfHMG5基因的缺失和过量表达都降低褐腐病菌的生长速率和产孢能力,但不影响其致病力。MfHMG6基因的缺失降低了褐腐病菌的生长速率、致病力和产孢能力,且导致MfHMG5基因的表达量升高。本研究结果说明MfHMG5和MfHMG6参与调控桃褐腐病菌的生长与致病。

假禾谷镰孢(Fusarium pseudograminearum)引起的小麦茎基腐病在我国发生日益严重,已对我国小麦的产量和品质造成了严重影响。Sey1属于RHD3(Root hair defective 3)家族,其编码的类动力蛋白GTPase参与内质网的融合,而内质网参与多种病原真菌脱氧雪腐镰刀菌醇(DON)的合成,但在假禾谷镰孢中还没有相关报道。本研究对假禾谷镰孢Sey1蛋白(FpSey1)进行了亚细胞定位,发现FpSey1定位于内质网上。通过PEG介导原生质体转化和Southern杂交筛选获得了FpSEY1基因敲除突变体ΔFpSey1及其回补菌株。同野生型菌株相比,敲除突变体ΔFpSey1的菌丝生长速率、分生孢子产量以及DON合成相关基因(TRI1、TRI5、TRI10)的表达量均显著下降,在小麦胚芽鞘和大麦叶片上形成的病斑明显变小,且ΔFpSey1突变体对盐胁迫和过氧化氢(H₂O₂)敏感,但对二硫苏糖醇(DTT)耐受。上述结果表明,FpSey1参与菌丝生长、产孢和致病力形成,在假禾谷镰孢生长和侵染阶段发挥着重要作用。

甘蔗白条病是一种由白条黄单胞菌(Xanthomonas albilineans, Xa)引起的细菌性病害,明确Xa的致病机理对甘蔗白条病的防治具有重要意义。在以往的研究中,双组分系统中跨膜的组氨酸蛋白激酶Phoq通过感受外界信号,激活胞内激酶活性,进而调节下游基因的转录水平,是黄单胞菌中重要的信号传递因子。本研究收集了包括Xa在内的能引发植物病害的8种黄单胞菌的Phoq蛋白序列。经过系统发育分析、蛋白质保守基序预测等,发现这8种黄单胞菌中的Phoq蛋白质结构保守,且具有相似的理化性质。进一步采用同源重组双交换的方法对Xa-JG43菌株中的phoq基因进行敲除,发现Xa-phoq敲除突变体的游动性和致病性相比野生型菌株明显减弱,但涌动性和抗胁迫能力不变,而Xa-phoq基因回补菌株的这些性状又恢复至野生型水平,表明Xa-phoq基因是菌体维持运动性和致病性所必需的。研究结果为进一步确定Xa的致病机理奠定了基础。

以假禾谷镰刀菌(Fusarium pseudograminearum)为主要病原引起的茎基腐病是小麦生产中的一种重要病害。为了建立一种快速、可靠的针对假禾谷镰刀菌的检测方法,本研究基于RPB序列设计了一对特异性PCR引物(Fpg-F1/R2),并通过实时荧光定量PCR(qPCR)验证了该引物的有效性。结果表明,该引物对假禾谷镰刀菌具有较高的特异性,DNA检测灵敏度为100 pg。基于引物Fpg-F1/R2建立的qPCR检测系统可用于假禾谷镰刀菌的早期快速检测,其扩增效率为87.5%,相关系数为0.99。此外,利用该检测系统确定了土壤中假禾谷镰刀菌引致病害发生的含量阈值,发现当该菌在田间土壤中含量大于213 pg·g^-1时可引发小麦茎基腐病。本研究建立的基于qPCR的假禾谷镰刀菌检测方法具有较高的特异性和灵敏度,可用于发病组织和田间土壤中该病菌的早期、快速检测。

由灰葡萄孢(Botrytis cinerea)引起的灰霉病害可造成农作物严重减产,而分泌蛋白在灰葡萄孢的侵染过程中起着重要作用。但迄今为止,对灰葡萄孢分泌蛋白功能和作用机理的研究仍有待进一步的深入。本研究从灰葡萄孢侵染时期的分泌蛋白组中筛选到1个分泌蛋白BcSGP1,该基因在灰葡萄孢侵染期上调表达。将BcSGP1基因敲除后,基因敲除转化子的致病力降低,但生长速度、产孢量和抗逆性没有变化。通过农杆菌注射法在本氏烟草叶片中瞬时表达BcSGP1后能引起叶片坏死,并且其诱导植物坏死的活性依赖于植物中的类受体激酶BAK1,但不依赖于类受体激酶SOBIR1。此外,BcSGP1还能诱导植物对灰葡萄孢的抗病性。以上结果表明,BcSGP1是一个致病相关分泌蛋白,并参与诱导植物的抗性,在灰葡萄孢与植物互作中起着重要作用。研究结果增强了对灰葡萄孢致病机制的理解,为灰霉病害的有效防治提供理论依据和基因资源。

近年来,由禾谷镰孢(Fusarium graminearum)侵染引起的小麦赤霉病、玉米茎腐病和穗腐病频繁发生,造成严重的农作物产量损失。为了解禾谷镰孢的遗传多样性以及挖掘其致病相关基因,本研究利用单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism,SNP)技术,对93份来自世界不同地区的禾谷镰孢进行群体遗传分析和选择消除分析。利用基因组分析工具箱(Genome Analysis Toolkit 4,GATK4)对这些禾谷镰孢的全基因组重测序数据进行处理,获得了3,817,652个SNP标记。基于SNP获得的系统发育树、主成分分析(PCA)及群体遗传结构分析结果,将这些禾谷镰孢分为3个类群。基于选择性降低,对类群1和类群2进行选择消除分析,结果发现类群1受到的选择压力更大。在群体多态性(θπ)和群体分化指数(Fst)两者交集的前5%区域确定了70个受选择区域,依据基因组位置信息获得了76个蛋白编码基因。进一步通过KEGG通路富集分析,以及候选基因在禾谷镰孢-寄主植物互作过程中的转录水平分析,初步确定了其中8个基因(FGSG_05447、FGSG_05610、FGSG_10272、FGSG_10313、FGSG_01353、FGSG_05545、FGSG_10858和FGSG_12745)与禾谷镰孢的致病性密切相关。研究结果为揭示禾谷镰孢致病机理以及小麦和玉米相应抗性品种的选育奠定了基础。

由致病疫霉(Phytophthora infestans)引起的晚疫病严重危害番茄的产量和品质。番茄对晚疫病存在阶段性抗性,但具体抗性机制尚不清楚。本研究以番茄品种“小汤姆”为供试材料,发现该品种幼苗期(株龄4周)比成株期(株龄8周)更抗晚疫病。利用RNA测序和实时荧光定量PCR技术富集并验证了幼苗期番茄茉莉酸(Jasmonic acid, JA)生物合成途径中AOS1、AOS2和AOC等基因的转录水平显著高于成株期植株。植物激素检测结果也显示,番茄叶片中JA含量在幼苗期显著高于成株期。在本生烟叶片中瞬时表达AOS1、AOS2、AOC等基因均增强了烟草对晚疫病的抗性,表明这些JA合成相关基因的表达水平和植物对晚疫病的抗性水平之间呈正相关。体外喷施茉莉酸甲酯(Methyl Jasmonate,MeJA)能提高番茄植株对晚疫病的抗性,而喷施JA合成抑制剂DIECA则使番茄更感晚疫病,进一步证明了JA正向调控番茄对晚疫病的抗性。上述结果表明,JA合成相关基因的差异表达在番茄对晚疫病的阶段性抗性中发挥着重要作用。本研究为利用阶段性抗性防治番茄晚疫病提供了重要依据。

含PilZ结构域蛋白是目前最大的一类c-di-GMP受体,但该类受体在猕猴桃溃疡病菌(Pseudomonas syringae pv. actinidiae, Psa)中的功能及其作用机制都未见报道,揭示其在Psa中的功能及调控机制,为猕猴桃溃疡病的防治提供新思路。首先对Psa M228进行全基因组分析及序列比对,对PilZ结构域蛋白进行鉴定及c-di-GMP结合保守位点分析;同源重组法构建单基因缺失突变体,叶盘真空渗透、软琼脂平板和生长曲线测定法分别测定突变体与野生型的致病力、运动性及生长速率差异;qRT-PCR测定T3SS和鞭毛相关基因的转录量分析PSA_2195是否对Psa的致病力和运动性存在转录调控。结果显示Psa M228中共有8个含PilZ结构域蛋白,其中PSA_2195和PSA_1975没有与c-di-GMP结合的保守基序RxxxR和(D/N)xSxxG。8个含PilZ结构域蛋白存在功能分化,与野生型M228相比,ΔPsa_1116、ΔPsa_2195、ΔPsa_2203、ΔPsa_762、ΔPsa_4490和ΔPsa_4763的致病力显著减弱,ΔPsa_2195、ΔPsa_762、ΔPsa_1116和ΔPsa_3989的泳动和群集运动能力显著减弱,生长速率之间没明显差异。其中,PSA_2195通过在转录水平上调控鞭毛合成、T3SS等相关基因影响Psa的运动性和致病性。总而言之,本研究对Psa M228中的8个含PilZ结构域蛋白功能进行了系统研究,并重点揭示了PSA_2195调控运动性和致病性的分子机制。

在对水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae, Xoo)PXO99^A-GX菌株的基因组注释过程中发现了一个非典型趋化受体基因PXO_01024,预测其产物具有2个跨膜结构域(TMD)和1个甲基接收结构域(MA),但缺少配体结合结构域(LBD)。为明确该基因的生物学功能,本研究通过同源双交换的方法构建了PXO_01024的缺失突变体DM01024。该基因缺失导致细菌的游动性几乎丧失,生物被膜减少,而互补菌株CDM01024的这些性状又恢复至野生型水平;在有伤接种条件下,DM01024的毒力与野生型相比并无明显变化,但是在喷雾接种(无伤)条件下,DM01024的病情指数相比野生型显著降低,而CDM01024的毒力又恢复至野生型水平,说明PXO_01024在侵染早期发挥作用;利用毛细管法对野生型及突变体DM01024进行趋化性检测,发现DM01024对甲硫氨酸、丙氨酸、亮氨酸、甘氨酸、天冬酰胺、苯丙氨酸、异亮氨酸、葡萄糖、麦芽糖、木糖、果糖、琥珀酸和酒石酸的趋向性相比野生型显著下降。本研究表明,非典型趋化受体基因PXO_01024与Xoo的趋化性、游动性和早期侵染相关。

由柑橘黄单胞柑橘亚种(Xanthomonas citri subsp. citri,Xcci)引起的柑橘溃疡病是我国柑橘生产上的一种重要病害。我们在前期研究中发现,Xcci广西菌株N8中有一个与306菌株的XAC3126同源的基因,可能参与调控病原菌的致病性。预测该基因编码一个单功能反应调控蛋白。为明确该基因的生物学功能,本研究对该基因进行缺失突变和功能互补,获得了相应的缺失突变体和互补菌株。致病性测定发现,该基因缺失导致Xcci在柑橘上的致病性显著下降,并且其胞外多糖产量、运动性,以及生物膜形成能力均显著降低,而互补菌株的这些表型恢复至野生型水平。进一步通过RT-qPCR分析该基因缺失对Xcci运动性相关基因及胞外多糖相关基因转录的影响,发现相比野生型菌株,缺失突变体在丰富培养基NB中培养时,这些基因的表达均下降,表明该基因的产物是通过调控多种致病因子的表达来影响病原菌在柑橘上的致病性。据此,我们将该基因命名为embR (Extracellular polysaccharide, motility and biofilm formation related regulator)。

编码马铃薯 Y 病毒(potato virus Y,PVY) CI 蛋白的核酸序列具有多个类似原核生物启动子元件的区域,有可能在原核细胞中翻译出对原核细胞具有毒性的蛋白,因此该序列难以按照常规的试验方法进行载体构建。在不改变CI氨基酸序列的基础上,对编码CI的核酸序列进行改造,成功构建了含有CI开放阅读框(ORF)的表达载体,利用真核无细胞蛋白表达系统成功实现了CI 蛋白的表达。通过亲和层析纯化,将CI蛋白免疫 Balb/c 小鼠,共制备了 6株单克隆抗体。间接 ELISA 和 Western blot 免疫印迹证明,其中4B7_2D6(IgG1)单克隆抗体,灵敏度最高,特异性最强。CI 蛋白的成功表达及单克隆抗体的获得,为后续研究 CI 蛋白的结构与功能提供了前提条件,对进一步探索 CI 与植物蛋白互作机理以及 PVY 的检测技术具有重要意义。

Myb转录因子广泛参与调控植物生长发育以及应对环境胁迫,但有关其对晚疫病抗性调控机制的研究较少。本研究从本氏烟草中克隆获得一个含Myb-like结构域的蛋白编码基因,命名为NbMybl。该基因开放阅读框全长为753 bp,编码250 aa。实时荧光定量PCR(qPCR)结果显示NbMybl受致病疫霉(Phytophthora infestans)侵染诱导表达。亚细胞定位表明NbMybl定位在植物细胞核和细胞质中。利用病毒诱导的基因沉默技术,发现沉默NbMybl能够明显降低本氏烟草对致病疫霉的抗性。分析比较NbMybl沉默和非沉默对照烟草株系应对P. infestans侵染的转录组数据,发现差异表达基因(Differentially expressed genes, DEGs)8486个,其中上调基因4202个,下调基因4284个。使用KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)数据库进行基因富集分析,发现鉴定得到的DEGs中共有373个参与植物-病原菌互作,308个参与植物激素信号转导,216个参与植物MAPK信号途径。推测这些DEGs可能与沉默NbMybl降低本氏烟草抗病性有密切关联。qPCR检测部分DEGs的表达,发现其表达趋势与转录组数据一致。本研究为阐明NbMybl参与对抗致病疫霉侵染提供了理论依据。

半胱天冬氨酸酶(caspase)在哺乳动物中参与调控细胞凋亡过程,控制着多种疾病的发生发展。本研究利用基因敲除和回补的方法,获得了禾谷镰孢中半胱天冬氨酸酶基因FgCas4的敲除突变体ΔFgCas4和回补体ΔFgCas4-C。通过观察分析发现,基因FgCas4的缺失并不影响禾谷镰孢(Fusarium graminearum)的生长速率、菌落形态、分生孢子产量、致病和产毒。但是,敲除突变体ΔFgCas4的菌丝分支变多且具有3个隔膜的分生孢子比例较野生型和回补体增加了8.7%。对外界环境胁迫因子耐受性测定显示,ΔFgCas4对杀菌剂和金属离子的敏感性显著增加,同时其细胞内脂滴含量增多,对渗透胁迫因子抗性变强。亚细胞定位发现,半胱天冬氨酸酶FgCas4定位于液泡中。此外,基因FgCas4的缺失导致F. graminearum细胞自噬过程明显提前。上述研究结果表明,F. graminearum中半胱天冬氨酸酶FgCas4主要在菌体无性繁殖、对不同环境胁迫的应答以及细胞自噬过程中发挥重要作用。

青枯雷尔氏菌 (Ralstonia solanacearum)引起的青枯病严重威胁着番茄的产量和品质。冠菌素 (Coronatine,COR)是由丁香假单胞菌 (Pseudomonas syringae)产生的化合物,结构类似于茉莉酸异亮氨酸 (JA-Ile)。本研究通过观察COR处理番茄后接种R. solanacearum的症状表现,发现COR处理的番茄植株比未处理的对照组青枯病发生症状轻。为进一步探究COR如何影响番茄对青枯病的抗性,对COR处理后接种R. solanacearum 24 h的番茄样品进行转录组测序分析,结果发现,COR处理共诱导了2122个差异表达基因,包括998个上调表达基因和1124个下调表达基因。通过对差异表达基因进行GO和KEGG富集,发现COR主要影响植物-病原菌互作通路及植物激素信号转导途径相关基因的表达。此外,COR还诱导JA合成通路相关基因的上调表达,以及抑制光合作用相关基因的表达。研究结果为深入揭示COR在植物-青枯病原菌互作过程中的作用奠定了理论基础。